Ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases, produzido por Streptomyces clavuligerus, usado clinicamente em combinação com antibióticos β-lactâmicos para tratar infecções bacterianas resistentes. Apesar da produção industrial de AC já ser bem estabelecida muitos aspectos importantes relacionados com sua biossíntese permanecem carentes de estudo. Sabe-se que a via de síntese do AC envolve no mínimo 8 passos enzimáticos sendo os primeiros passos mais abordados. Por exemplo, as enzimas N2-(2-carboxietil) arginina sintase (CEAS), β-lactama sintase (BLS) e proclavaminato amidino hidrolase (PAH) são as responsáveis pela primeira, segunda e quarta reações enzimáticas respectivamente. Estudos mutagênicos recentes em S.clavuligerus relacionaram cópias extras dos genes ceas, bls e pah (ceas1, bls1 e pah1) com essa via porém nenhum ensaio enzimático foi relatado. Embora os passos finais da via ainda não estejam completamente estabelecidos, a ação de algumas enzimas putativas, como a codificada por orf12, mostraram ser essenciais a produção do AC. Assim, com o objetivo de aumentar a informação disponível sobre a biossíntese do AC estudamos quatro de seus membros: CEAS1, BLS1, PAH1 e a proteína putativa codificada pela orf12. Os genes foram isolados a partir do DNA genômico de S. clavuligerus por PCR e clonados em vetores para produção das proteínas recombinantes em E.coli. Os protocolos de expressão foram estabelecidos para CEAS1, PAH1 e ORF12 e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade por metal. BLS foi obtida de forma isolúvel. As proteínas solúveis foram caracterizadas por meio de técnicas bioquímicas e estruturais. As análises de CEAS1 e PAH1 foram comparadas com informações já obtidas para as isozimas CEAS2 e PAH2, respectivamente. Assim, as análises de oligomerização das proteínas resultaram em uma mistura de oligômeros (monômero, dímero e tetrâmero) para CEAS1, na forma hexamérica para PAH1 e na forma dimérica para ORF12, estando de acordo com as formas solúvel e cristalográfica de CEAS2 (dímero e tetrâmero) e PAH2 (hexâmero). Espectros de dicroísmo circular mostraram que CEAS1 e PAH1 possuem um enovelamento do tipo α/β sendo estáveis até 35ºC e numa ampla faixa de pH. Os parâmetros termodinâmicos da interação entre CEAS1 e o cofator Mg+2 foram determinados mostrando que é entropicamente dirigida, com uma estequiometria de ligação de 4 : 1, com uma constante de afinidade na ordem de micromolar (KD = 1,76 ± 0.23 µM). Análises realizadas com as técnicas de reação acoplada, de Cromatografia Líquida de Alta Pressão acoplada a Espectrometria de Massas (LC-MS) e de Calorimetria de Titulação Isotérmica mostraram que CEAS1, assim como CEAS2, apresenta atividade sob o substrato gliceraldeído-3-fosfato, porém sem a formação do produto final N2-(2-carboxietil)arginina. Por outro lado, a proteína recombinante PAH1 mostrou ser inativa sobre o substrato análogo, N-α-acetil-L-arginina. Assim, apesar das isozimas manterem um padrão estrutural, podem ter mecanismos de ação distintos. Em relação a ORF12 esta proteína foi classificada com uma β-lactamase com atividade esterase de acordo com nossos estudos realizados com os substratos cefalosporina C e p-nitrofenil acetato. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases, produced by Streptomyces clavuligerus, clinically used in combination with β-lactam antibiotics to treat resistant bacterial infections. Although CA industrial production is well-established, many important aspects related to its biosynthesis remains under study. It is known that CA pathway involves at least 8 enzymatic steps, being the earliest stages more addressed. For instance, N2-(2-carboxyethyl) arginine synthase (CEAS), β-lactam synthase (BLS) and proclavaminate amidinohydrolase (PAH) are responsible for the first, second and fourth enzymatic reaction, respectively. Recent mutagenic studies in S.clavuligerus have related extra copies of ceas, bls and pah genes ((ceas1, bls1 e pah1) to this pathway but none enzymatic assay was further reported. Although later stages the pathway remain unclear, the action of some putative enzymes like the codified by orf12 showed essential to CA production. Thus, aiming to increase the information available about CA biosynthesis we studied four of its members: CEAS1, BLS1, PAH1, and the putative protein codified by orf12. The genes were isolated from S.clavuligerus genomic DNA by PCR and further cloned into expression vectors in order to produce recombinant proteins in E.coli. Protocols of protein expression were established to CEAS1, PAH1 and ORF12 and recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography. BLS was obtained as an insoluble form. Soluble proteins were characterized by means of biochemical and structural approaches. Analyses of CEAS1 and PAH1 were compared with information ever conducted to the isozymes CEAS2 and PAH2, respectively. Thus, oligomerization analysis of proteins resulted respectively in a mix of oligomers forms (monomer, dimer, tetramer) to CEAS1, hexameric form to PAH1 and dimeric form to ORF12, according to the soluble and crystallographic form of CEAS2 (dimer and tetramer) and PAH2 (hexamer). Circular Dichroism spectra showed that CEAS1 and PAH1 have an α-β conformation and were stable up to 35ºC over a wide pH range. Thermodynamic parameters of CEAS1 cofactor (Mg+2) binding were determined showing that is entropic driven, with a 4:1 binding stoichiometry, with a micro-molar affinity (KD = 1.76 ± 0.23 µM). Analyses by coupled assay, High Pressure Liquid Chromatography coupled to Mass Spectroscopy (LC-MS) and Isothermal Titration Calorimetry showed that CEAS1, as well as the CEAS2, presents activity at the substrate glyceraldehydes-3-phosphate, however without formation of final product, N2-(2-carboxyethyl)arginine. Meanwhile recombinant PAH1 showed none activity at analogous substrate, N-α-acetil-L-arginine. Thus despite isozymes maintain a structural pattern, they may have distinct action mechanism. Regards to ORF12, this protein was classified as a β-lactamase with an esterase activity according to our studies performed with the substrates cephalosporin C and p-nitrophenyl acetate.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20122012-154241 |
| Date | 10 December 2012 |
| Creators | Vieira, Débora Fernanda |
| Contributors | Araujo, Ana Paula Ulian de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
Page generated in 0.0031 seconds