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Mecanismos moleculares e celulares de citotoxicidade de FGF2 parácrino em células tumorais dependentes de Ras / Molecular and cellular mechanisms of paracrine FGF2 cytotoxicity in Ras-driven tumor cells

Descrevemos, recentemente, que FGF2 parácrino dispara senescência nas linhagens celulares murinas Y1 e 3T3-B61, transformadas malignamente por Ras, mas sem ativação das vias apoptóticas (Costa et al., 2008). Nesta tese, estudamos os mecanismos celulares e moleculares desta resposta de estresse irreversível, disparada por FGF2. Focalizamos, principalmente, a linhagem Y1, que carrega uma amplificação do oncogene Kras, mas apresenta um controle parcial da transição G0/G1 → S do ciclo celular. Por estas características fenotípicas, as células Y1 foram utilizadas no estudo dos mecanismos das ações antagônicas de FGF2, isto é, a atividade mitogênica clássica e a nova ação citotóxica que causa senescência. Análises de citometria de fluxo e marcação com BrdU mostraram que FGF2 promove a transição G0/G1 → S (atividade mitogênica), mas bloqueia a progressão através de S e G2/M (atividade antimitogênica). Ensaios de viabilidade celular (MTS e Cyto-Tox) demonstraram que, durante o bloqueio do ciclo celular por FGF2, as células permanecem íntegras e metabolicamente ativas, embora exibam alterações morfológicas, que sugerem estresse celular. Além disso, experimentos de tomada de 3H-timidina em DNA evidenciaram que, já nas primeiras horas de G1, FGF2 dispara um processo antimitogênico que só tardiamente vai se manifestar na fase S, bloqueando a síntese de DNA. Verificamos ainda, que o inibidor específico da Tyr-quinase dos receptores de FGF, PD173074, abole completamente, tanto os efeitos mitogênicos como os antimitogênicos de FGF2 nas células Y1, demonstrando que ambos os processos iniciam-se com a ativação da Tyr-quinase dos FGFRs. Por outro lado, inibidores específicos das vias de sinalização de MEK/ERK, PI3K/AKT e PKC (todas mitogênicas e à jusante dos FGFRs) bloqueiam a progressão no ciclo celular, sem proteger as células Y1 de FGF2, evidenciando que estas vias mitogênicas não participam dos mecanismos moleculares citotóxicos disparados por FGF2. Entretanto, inibidores das Tyr-quinases Src protegem parcialmente as células Y1 de FGF2, implicando a família Src na transformação maligna destas células. Para buscar novos genes pertinentes à ação citotóxica de FGF2 analisamos expressão gênica por RT-qPCR, dando continuidade a estudos anteriores desenvolvidos no laboratório, através de microarranjos de cDNA (Asprino & Armelin, 2006). Desta busca, resultaram genes codificantes de proteínas envolvidas no controle de ciclo celular, adesão e citoesqueleto, com destaque para proteínas reguladoras de RhoGTPases e os receptores de FGF. Procuramos também examinar especificidades entre os FGFRs, quanto ao disparo das ações antagônicas de FGF2. As células Y1 expressam FGFR1IIIc, FGFR2IIIc e FGFR5 enquanto as 3T3-B61 expressam FGFR1IIIc e FGFR5. A redução da expressão de FGFR2 por RNAi, em células Y1, não impediu a ação citotóxica de FGF2, mas a redução de FGFR1 protegeu as células da ação morfológico-estressante de FGF2. Como FGFR5 não possui domínio de Tyr-quinase, concluímos que o FGFR1 é o receptor mais relevante para o efeito citotóxico de FGF2, em ambas as células. Em conclusão, FGF2 ativa a Tyr-quinase dos FGFRs, disparando mecanismos moleculares antagônicos, paralelos e independentes, onde o efeito final é o bloqueio do ciclo celular nas fases S e G2/M e, consequentemente, senescência celular. / We have recently described that paracrine FGF2 triggers senescence in Ras-driven murine cell lines Y1 and 3T3-B61, without activation of apoptotic pathways (Costa et al., 2008). On this thesis, we studied the molecular and cellular mechanisms of this irreversible stress response triggered by FGF2. We have mainly focused on the Y1 cell line, which carries Kras oncogene amplification, but presents a certain control of the G0/G1 → S cell cycle transition. Because of these phenotypic features, the Y1 cells were utilized to study the mechanisms of FGF2 antagonic actions, i. e., the classical mitogenic activity and the new cytotoxic action, which causes senescence. Flow cytometer analysis and BrdU labeling have shown that FGF2 promotes the G0/G1 → S transition (mitogenic activity), but arrests the progression through S and G2/M (antimitogenic activity). Viability assays (MTS and Cyto-Tox) have shown that, during the cell cycle arrest by FGF2, cells remain intact and metabolically active, although exhibiting morphologic alterations, which suggested cellular stress. Moreover, 3H-thymidine uptake into DNA has evidenced that, within the first hours of G1, FGF2 triggers an antimitogenic process that only lately will manifest in S phase, blocking DNA synthesis. We have further verified that the specific Tyr-kinase inhibitor, PD173074, completely abolishes both FGF2 mitogenic and antimitogenic effects, showing that both processes start at FGFRs Tyr-kinase. On the other hand, specific inhibitors of MEK/ERK, PI3K/AKT and PKC signaling pathways (all mitogenic and downstream of FGFRs) block the cell cycle progression, but do not protect cells from FGF2, showing that these pathways do not participate of the cytotoxic molecular mechanisms triggered by FGF2. However, Src Tyr-kinases inhibitors partially protect Y1 cells from FGF2, implicating the Src family on malignant transformation of these cells. To search new genes pertinent to the cytotoxic action of FGF2, we analyzed gene expression by RT-qPCR, continuing previous studies developed in our laboratory through cDNA microarrays (Asprino & Armelin, 2006). This search revealed protein-coding genes involved on cell cycle control, cellular adhesion and cytoskeleton, in which we highlighted regulatory proteins of RhoGTPases and FGF receptors. We also examined specificities among FGFRs in relation to FGF2 antagonic actions. Y1 cells express FGFR1IIIc, FGFR2IIIc and FGFR5 whereas 3T3-B61 cells express FGFR1IIIc and FGFR5. In Y1 cells, the knockdown of FGFR2 expression by RNAi do not stop FGF2 cytotoxic actions, but knockdown of FGFR1 expression protects cells from the FGF2 morphologic-stressing action. Since FGFR5 lacks Tyr-kinase domain, we concluded that FGFR1 is the most relevant receptor for FGF2 cytotoxic effect in both cells. In conclusion, FGF2 activates FGFRs Tyr-kinase, triggering parallel and independent antagonic molecular mechanisms, in which the final effect is the S and G2/M cell cycle arrest and, consequently, cellular senescence.

Identiferoai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06082009-150519
Date30 June 2009
CreatorsSalotti, Jacqueline
ContributorsArmelin, Hugo Aguirre
PublisherBiblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Source SetsUniversidade de São Paulo
LanguagePortuguese
Detected LanguagePortuguese
TypeTese de Doutorado
Formatapplication/pdf
RightsLiberar o conteúdo para acesso público.

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