nÃo hà / O cDNA da bodesina Bdh-2 presente no plasma seminal de caprino (Capra hircus) foi subclonado no vetor de expressÃo pTrcHis TOPO utilizado para transformar cÃlulas E.coli Top 10 One Shot. Os clones recombinantes foram selecionados atravÃs de crescimento em meio LB-Broth contendo 50 μg/mL de ampicilina e amplificaÃÃo do gene por PCR. A sÃntese da proteÃna recombinante rBdh-2 fusionada com cauda de histidina foi monitorada atravÃs de SDS-PAGE seguido por immunobloting usando anticorpo monoclonal anti histidina. A produÃÃo da rBdh-2 atravÃs da induÃÃo a baixas temperaturas nÃo se mostrou satisfatÃria. A maior produÃÃo da rBdh-2 ocorreu com IPTG 1,5 mM apÃs 2 horas de induÃÃo. O mÃtodo utilizado para a purificaÃÃo da proteÃna recombinante rBdh-2 foi atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna His-Trap seguida por cromatografia de troca-iÃnica em coluna de DEAE-Sephacel. A estrutura secundÃria da rBdh-2 foi avaliada atravÃs do perfil espectral de dicroÃsmo circular (CD) que confirmou a predominÃncia de estruturas secundÃrias do tipo folhas-β, a presenÃa de um baixo conteÃdo de estruturas nÃo-ordenadas e de hÃlices-. A rBdh-2 manteve sua estrutura estÃvel atà 35 ÂC. No entanto, mudanÃas significativas foram observadas a partir de 40 ÂC referentes à descaracterizaÃÃo do espectro de CD. / The Bdh-2 bodhesin cDNA present in seminal plasma of goat was subcloned in the expression plasmid pTrcHis TOPO used to transform E. coli Top10 One shot cells. The recombinant clones were selected by growth in 50 μg/mL ampicillin-containing LB-Broth medium and PCR amplifications. The recombinant protein synthesis was monitored by SDS-PAGE followed by immunoblotting using monoclonal anti-His antibody. The production of the rBdh-2 through low temperature was not satisfactory. A greater production of the rBdh-2 occurred with IPTG 1.5 mM after 2 h of induction. The method utilized to the purification of the rBdh-2 was realized in affinity chromatography on a His-Trap column following ion-exchange chromatography on a DEAE-Sephacel column. The secondary structure of the rBdh-2 was evaluated through spectral profile circular dichroism (CD) and confirmed the prevalence of secondary structures like β-sheets, the presence of a low content of unfolded structures and helices-. The rBdh-2 structure remained stable up to 35 ÂC. However, significant changes were observed from 40 ÂC related to a distortion of the spectrum of CD.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:3334 |
| Date | 02 February 2010 |
| Creators | Antonia SÃmia Fernandes do Nascimento |
| Contributors | Benildo Sousa Cavada, JoÃo Batista Cajazeiras, Jorge Luiz Martins |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Biotecnologia (Campus da UFC em Sobral-CE), UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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