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Previous issue date: 2015-08-28 / The cryopreservation of somatic cells has been highlighted not only in the preservation of germplasm, but also in the maintenance of genotypes used for the induction of pluripotency, development of strains and cloning by nuclear transfer. The study of the effects of controlled stress in somatic cells or gametes have shown that, in addition to providing increased survival under experimental conditions, it may influence other parameters like the growth pattern in culture. Bovine fibroblasts obtained by standard procedure from a cartilage explant were evenly distributed in four experimental groups as described below: fibroblasts in culture were subjected for 4 minutes to negative pressure 200, 500 and 800 mbar, immediately (PN0h) or 3 hours before (PN3h) freezing, performed in a standard solution (10% DMSO in D-MEM). After trypsinization, the cells were loaded in 0.25 mL straws in a concentration of 1 x 106 cells / mL, and total volume of 200 μL. The straws were sealed and stabilized in a refrigerator (5-7 °C) for 30 minutes, and then exposed to nitrogen vapor (4 cm above the surface) for 5 minutes when were dipped therein. Thawing was performed in a water bath at 36 °C for 20 seconds. Fibroblasts not subjected to pressure were used as frozen (CC) and fresh (FC) controls. There was evaluated the post-thaw viability and subsequently the cell replication index, based on the population doubling time (PDT) performed each 24 h intervals, during 8 days. At each evaluation, the cells of one well of each group were trypsinized and the number of viable cells determined by hemocytometric chamber after staining with Trypan Blue. PDT was determined using the algorithm available online (http://www.doubling-time.com): TD = t x lg2/(lgNt lgN0). Data were submitted to ANOVA and T student test, with 5% significance level. The average cell survival of control group (89.8%) and PN500 0h (88.1%) were higher than all other groups. The PDT average time of all frozen cells was 33.2 h. The PDT time was similar in fresh (27.5 ± 0.35 h), frozen control (30.1 ± 2.3 h) and PN500 0h (32.4 ± 1.6 h) groups. The lowest PDT time was observed in the PN800 0h (21,9h) group. The freezing in plastic straws with 10% DMSO was adequate to cryopreserve bovine fibroblasts allowing high survival rates. It was not observed negative effects of submission to the negative pressure just before freezing, and the level of 200 and 500 mbar resulted in growth rates similar to the obtained with fresh fibroblasts. Although the negative pressure has not increased cryotolerance in bovine fibroblasts, it determined changes in the behavior of these cells during the post-thaw culture. New evaluations should be performed to assess cells subjected to negative pressure in the development of animal clones / A criopreservação de células somáticas vem se destacando não apenas como aliada na preservação de germoplasma, mas também na manutenção de genótipos utilizados para a indução de pluripotencia, formação de linhagens e clonagem por transferência nuclear. O estudo dos efeitos do estresse controlado em gametas ou células somáticas tem demonstrado que, além de proporcionar maior sobrevivência em condições experimentais, outros parâmetros podem ser influenciados, como por exemplo, o padrão de crescimento em cultivo. Para isto, fibroblastos bovinos de primeira passagem, obtidos por procedimento padrão de explantação de cartilagem, foram distribuídos uniformemente em quatro grupos experimentais conforme descrito a seguir: Fibroblastos em cultivo foram submetidos por 4 minutos à pressão negativa de 200, 500 e 800 mbar, imediatamente (PN0h) ou 3horas antes (PN3h) do congelamento, realizado em solução padrão (10% DMSO em D-MEM). Após a tripsinização, as células eram envasadas em uma concentração de 1 x 106 células/mL, em palhetas de 0,25 mL, num volume total de 200 μL. As palhetas eram seladas e estabilizadas em geladeira (5-7 ˚C) por 30 minutos, expostas ao vapor de nitrogênio (4 cm acima da superfície) por 5 minutos, e então mergulhadas no mesmo. O descongelamento era realizado em banho-maria a 36 °C por 20 segundos. Fibroblastos não submetidos à pressão foram utilizados como controles congelado (CC) e fresco (FC). Foram avaliados a viabilidade pós-congelamento, e posteriormente o índice de replicação, baseado no tempo de duplicação da população (PDT) celular, com intervalos de 24h e duração de 8 dias. A cada avaliação, um poço de cada grupo era tripsinizado sendo o número de células viáveis determinado em câmara hemocitométrica, após a coloração com Azul de Trypan. O PDT foi
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determinado utilizando-se o algoritmo disponível online (http://www.doubling-time.com): TD = t x lg2/(lgNt lgN0). Os dados foram submetidos à ANOVA e teste T Student, com 5% de significância. A sobrevivência celular média dos grupos controle (89,8%) e PN500 0h (88,1%) foram superiores aos outros grupos. O tempo médio de PDT de todas as células congeladas foi 33,2h; o tempo de PDT foi semelhante nos grupos fresco (27,5 ± 0,35 h), controle congelado (30,1 ± 2,3 h) e PN500 0h (32,4 ± 1,6 h), o menor tempo foi observado no grupo PN800 0h (21,9 h). As palhetas plásticas se mostraram adequadas para o congelamento de fibroblastos bovinos, não sendo observados efeitos negativos da submissão à pressão negativa imediatamente antes do congelamento, sendo os valores de 200 e 500 mbar os que possibilitaram as melhores taxas de crescimento. Muito embora o emprego de pressão negativa não tenha aumentado a criotolerância de fibroblastos bovinos, determinou mudanças no comportamento destas células durante o cultivo pós-descongelamento. Novas avaliações devem ser realizadas para avaliar a qualidade das células submetidas à pressão negativa, no desenvolvimento de clones animais
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.udesc.br #179.97.105.11:handle/963 |
| Date | 28 August 2015 |
| Creators | Liposki, Diana de Matia |
| Contributors | Mezzalira, Alceu |
| Publisher | Universidade do Estado de Santa Catarina, Mestrado em Ciência Animal, UDESC, BR, Ciências Veterinárias |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UDESC, instname:Universidade do Estado de Santa Catarina, instacron:UDESC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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