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Previous issue date: 2013-02-22 / CNPq / A criptococose é uma infecção fúngica predominantemente oportunista cujos principais
agentes etiológicos são Cryptococcus neoformans e C. gattii. O tratamento de escolha para a
micose é a anfotericina B associada ou não a 5-fluorocitosina seguido de terapia de
manutenção com fluconazol. Contudo, falhas no tratamento associadas à toxicidade e ao
aparecimento de resistência aos fármacos têm sido relatadas, o que torna essencial a
descoberta de novas alternativas terapêuticas, como a ciclopirox olamina (CPO). Neste
contexto, o objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar a ação in vitro e in vivo da CPO
livre e encapsulada em lipossomas frente a amostras de Cryptococcus neoformans para futura
aplicação no tratamento da criptococose sistêmica. Foram obtidas 30 amostras de
Cryptococcus neoformans provenientes de pacientes imunocomprometidos. A preparação dos
lipossomas convencionais e furtivos de CPO foi realizada pelo método da hidratação do filme
lipídico e a caracterização foi realizada avaliando os seguintes parâmetros: tamanho de
partícula, Índice de Polidispersão (PDI) e taxa de encapsulação (EE%). Para otimização dos
constituintes lipídicos, foi realizado um planejamento fatorial fracionado a 24-1 a partir da
melhor formulação obtida nos estudos de pré-formulação. A cinética de liberação in vitro foi
conduzida para avaliar e comparar estatisticamente o perfil de liberação dos sistemas
convencional e furtivo. Adicionalmente, testes de susceptibilidade antifúngica foram
realizados de acordo com Clinical and Laboratotry Standards Institute (CLSI). Para
caracterização molecular dos isolados, PCR fingerprinting foi conduzida utilizando os primers
M13 e URA5. O estudo in vivo foi conduzido com camundongos imunossuprimidos,
infectados com Cryptococcus neoformans (106 cels/mL) e tratados com CPO lipossomal
(Lipo-CPO) (0.5 mg/Kg). As concentrações de CPO utilizadas na forma livre e encapsuladas
em lipossomas convencionais e furtivos variaram de 0,30 a 625 µg/mL. Os resultados do
planejamento fatorial mostraram que o ponto central apresentou características proeminentes
com redução do tamanho de partícula em 17,1%; melhora do PDI em 15,34% e da quantidade
de fármaco encapsulado (25%). A cinética do lipossoma furtivo apresentou uma velocidade
de liberação mais controlada quando comparada ao lipossoma convencional. Com relação ao
teste de susceptibilidade, todos os inóculos foram susceptíveis a CPO livre, com atividade
fungistática entre 0,30 e 0,61 g/mL e fungicida entre 1,22 e 4,88 g/mL. Não houve
diferença relacionada à atividade antifúngica entre as formulações lipossomais convencionais
e furtivas. A atividade fungistática dos lipossomas foi observada em concentrações variando
de 1,22 e 2,44 g/mL. A faixa das concentrações fungicidas foi de 1,22 a 9,76 g/mL. O
padrão de bandas do URA5 revelou que todos os isolados apresentam genótipo VNI,
característico de C. neoformans. Lipo-CPO apresentou eficácia antifúngica comparada à
anfotericina B após 14 dias de infecção, reduzindo a carga fúngica em aproximadamente 8%
no baço, 41% no fígado, 63% no pulmão e 89% no cérebro. O exame histológico evidenciou
infiltrado celular no fígado dos grupos tratados com Lipo-CPO e anfotericina B, porém com
menor intensidade quando comparado ao grupo controle. O estudo sugere que a CPO
encapsulada em lipossomas apresenta significativa ação antimicótica frente às amostras
sistêmicas de C. neoformans, reforçando seu potencial na terapêutica da criptococose. / Cryptococcosis is an opportunistic fungal infection whose the main ethiological agents
are Cryptococcus neoformans and C. gattii. The treatment of choice for this mycosis is
amphotericin B combined or not with 5-fluorocytosine, followed by maintenance therapy with
fluconazole. However treatment failures associated with toxicity and drug resistance has been
reported, which makes it essential to the discovery of new therapies, such as ciclopirox
olamine (CPO). The purpose of this study was to characterize and evaluate the in vitro and in
vivo antifungal activity of ciclopirox olamine in its free form and encapsulated in liposomes
against thirty Cryptococcus neoformans isolates obtained from immunocompromised patients
for future application in systemic cryptococcosis treatment. Preparation of conventional and
stealth liposomes was performed to define particle size, polydispersity index (PDI), CPO
amount of encapsulated and efficiency of encapsulation (EE%). For optimization of liposomal
lipid constituents, a 24-1 fractional factorial design was carried out from the prominent
formulation obtained in pre-characterization studies. In vitro release kinetics was conducted to
evaluate and compare statistically the release profile of conventional and stealth liposomes.
Antifungal susceptibility testing was conducted in accordance with the reference method.
Regarding molecular characterization, PCR fingerprinting was carried out by using MT3 and
URA5 primers. Concentrations of CPO used in free form and encapsulated into stealth and
conventional liposomes ranged from 625 to 0.3 g.mL-1. Despite of the central point of the
factorial design have increased the total lipids amount in 35.52%, it showed prominent
characteristics when compared with the L4 formulation with improvement of the mean size in
17.1%, PDI in 15.34% and CPO amount in 25%. The minimum concentrations of
stearylamine to obtain the stable formulation for one month was 5.88 mM. . Kinetics of
stealth liposomes showed a release profile more controlled as compared to conventional
liposomes. All inoculations were susceptible to CPO in its free form, presenting fungistatic
activity between 0.3 and 0.61 g.mL-1 and fungicidal activity between 1.22 and 4.88 g.mL-1.
There was no difference with respect to antimycotic activity between conventional and stealth
liposomal formulations. Fungistatic activity of liposomes was observed at concentrations
ranging from 1.22 and 2.44 g.mL-1. Fungicidal concentration range was 1.22-9.76 g.mL-1.
The URA5 profile analized demonstrated all isolates are VNI genotype (C. neoformans). The
treatment with Lipo-CPO showed a reduction of 8% of the C. neoformans population in
spleen, 40.8% in liver, 63% in lungs and 89% in brain after 14 days of infection. Histological
examination revealed cell infiltrate either Lipo-CPO or Amphotericin B treated groups, but
less intense when compared to control group. The results suggest that Ciclopirox olamine
loaded-liposomes have significant antimycotic activity against Cryptoccocus spp, reinforcing
its potential for in vivo studies and its application in cryptococcosis treatment.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/18294 |
| Date | 22 February 2013 |
| Creators | KOCERGINSKY, Patrícia de Oliveira |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/1063790618901917, MAGALHÃES, Nereide Stela Santos, NEVES, Rejane Pereira |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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