Nanomedicine is one of the most promising fields in nanotechnology nowadays. The use of nanoparticles as carriers aims to improve efficiency of drugs that possess low solubility in aqueous environment (very hydrophobic molecules) or that have a lot of undesired side effects. In this way, nanoparticles offer both a protection for the molecules and a carrying vehicle. On this ground, cubosomes are nanoparticles capable of storing both hydrophilic and hydrophobic molecules within its structure, in addition, cubosomes have approximately 50% hydrophilic and hydrophobic areas. Therefore, they can carry much more molecules than liposomes for instance. In particular, cubosomes are quite easy to produce due to its base product, lipids (like monoolein (GMO) or phytantriol (PHY)) that self-assembly in water media. In this project, both lipids were chosen to produce the cubosomes from well-established protocols in literature. A model drug, miletofsine (MILT), was chosen to study the interaction of such nanosystem with a guest molecule. GMO cubosomes revealed to have Im3m crystallographic symmetry and lattice parameter 15.3(7) nm, particles presented sizes 300(8) nm and moderate polydispersion 0.160(20). TEM revealed squared particles with sizes ~350 nm, cryo-EM presented particles with internal structure and varied size (from 200 to > 500 nm). From FFT analysis, the calculated lattice parameter remained in the order of ~10 nm compatible with SAXS measurements. MILT loading into cubosomes was possible up to 4% w/w without loss of cubosomes structure. For 5% w/w MILT, the nanoparticles were already loosing their crystalline structure, as evidenced by cryo-EM. TEM analysis reveals that as more MILT is loaded into the cubosomes, their sizes increased. For sample 1.5% w/w MILT cryo-EM presents nanoparticles with organized internal structure and an envelope (hypothesized to be a polymer coating) in its surface. Calculated lattice parameters are in the order of ~10 nm. Myverol (Myv) is a commercial mixture that contains ~60% GMO, in this project it was proposed a bottom up protocol for Myv-based cubosomes. The production of these nanoparticles also revealed, by SAXS, Im3m symmetry and lattice parameter 12.30(12) nm. DLS revealed particle size 280(5) nm and moderate polydispersion 0.115(52). TEM shows square and cubic nanoparticles with sizes ~500 nm. MILT loading into Myv-cubosomes revealed that the drug interacts with the nanoparticle by enlarging their lattice parameter as more MILT is loaded (up to 4% w/w). Curiously, for some MILT concentrations the presence of other unknown cubic structures was evidenced by SAXS. TEM revealed nanoparticles with huge polydispersion, with sizes raging from 200 nm to 2 µm. PHY based cubosomes were successfully reproduced by the chosen protocol, in both water, PBS buffer and 2.25% glycerol medium. SAXS revealed crystallographic structure Pn3m and lattice parameter 6.74(04) nm. DLS measured sizes ~450 nm and moderate polydispersion 0.161(10). NTA measurements were consistent with DLS, revealing a broad size distribution and total particle concentration of ~1016 particles/mL for each sample. TEM revealed square and rounder particles in varied size. Cryo-EM micrographs presented particles with internal structure and varied size confirming moderate polydispersion. The FFT analysis revealed calculated lattice parameters ~6.5 nm, compatible with SAXS data. Samples were submitted to lyophilization and found that after re-hydration they still hold the same characteristics (morphology, size) as the original sample. Extrusion was also performed in order to improve polydispersion and control particle size, again cubosomes held their internal structure after the process, diminishing their sizes and improving monodispersion. MILT was loaded into cubosomes via co-solubilization and addition after the nanoparticles were formed. Up to 5% w/w the cubosomes incorporated MILT without loss of crystallographic structure, but at 10%, 15% and 20% w/w, the drug provoked phase change for Im3m symmetry. At the lower concentrations, MILT enlarged the lattice parameter of cubosomes and it was hypothesized that MILT inserted itself into the bilayer of the nanoparticles. DLS reveales that the drug does not change particle size or polydispersion. TEM revealed square and rounder particles in sizes slightly bigger than DLS. For sample 4% w/w, Cryo-EM presented particles with internal structure and calculated lattice parameter ~7 nm compatible with SAXS measurements for this sample. Co-solubilization and addition after nanoparticle preparation proved out to have the same effect on cubosomes loaded with MILT. All samples were submitted to higher temperatures to investigate phase change, based on phase diagram of the lipid. It was found that for the blank samples at 65 °C the cubosomes suffer phase change for isotropic phase L2, when MILT is loaded into the nanoparticles this phase change does not happen. DLS revealed also that at higher temperatures, particle size does not change, neither polydispersion. Finally, cubosomes proved to be remarkable nanoparticles that hold their physico-chemical characteristics even when submitted to extreme environments (lyophylization, extrusion and higher temperatures.) / Nanomedicina é o campo de estudo mais promissor dentro da nanotecnologia atualmente. O uso de nanopartículas visa melhorar a eficiência de fármacos que possuem baixa solubilidade em meios aquosos (moléculas muito hidrofóbicas) ou que possuem muitos efeitos colaterais indesejados. Neste contexto, as nanopartículas oferecem proteção e veículo para tais moléculas. Para isso, cubossomos são nanopartículas capazes de encapsular tanto as moléculas hidrofóbicas como as hidrofílicas em sua estrutura. Cubossomos também apresentam aproximadamente 50% de áreas hidrofílica e hidrofóbica, sendo capaz de encapsular grandes quantidades de moléculas teóricamente. Particularmente, cubossomos são nanopartículas de fácil produção devido à sua matéria prima serem lipídios (por exemplo, monoleína (GMO) ou fitantriol (PHY)) que se auto associam em meio aquoso. Neste projeto, os dois lipídios citados foram escolhidos para a produção dos cubossomos empregando-se protocolos bem estabelecidos da literatura. Uma fármaco modelo, miltefosina (MILT), foi escolhida para o estudo da interação com as nanopartículas. Cubossomos de monoleína (GMO) revelaram simetria cristalográfica Im3m e parâmetro de rede de 15.3(7) nm, as nanopartículas apresentaram tamanhos em torno de 300(8) nm e PDI 0.160(20). MET revelou partículas quadradas com tamanhos ~350 nm e a crio microscopia mostrou partículas com estrutura interna bem definida e tamanhos variados (200 a 500 nm), os parâmetros de rede calculados se mostraram da ordem de ~10 nm, compatíveis com as medidas de SAXS. O encapsulamento da MILT nos cubossomos foi possível até 4% w/w sem perda de morfologia. Para 5% w/w MILT as nanopartículas já apresentavam perda de cristalinidade na sua estrutura, evidenciado por crio microscopia. Análise por MET revelou que quanto mais MILT era encapsulada nos cubossomos, maiores ficaram as nanopartículas. Com a amostra de 1.5% w/w foi feita a crio microscopia, que revelou cubossomos com estrutura interna bem definida e um envelope (possivelmente formado pelo polímero) na sua superfície. Os parâmetros de rede calculados foram da ordem de ~10 nm também. O myverol (Myv) é uma mistura comercial que contém aproximadamente 60% de GMO, e neste projeto foi proposto um protocolo bottom up para cubossomos feitos de Myv. A produção dessas nanopartículas também revelou, por SAXS, estrutura cristalográfica Im3m e um parâmetro de rede de 12.30(12) nm. DLS apresentou partículas de tamanho 280(5) nm e polidispersão moderada 0.115(52). MET mostrou partículas quadradas e cúbicas com tamanhos de ~500 nm. O encapsulamento da MILT revelou que o fármaco interage com os cubossomos aumentando seu parâmetro de rede, até uma concentração de 4% w/w. Curiosamente, para algumas concentrações de MILT havia presença de outras estruturas evidenciadas por SAXS. MET revelou nanopartículas com muita polidispersão, com tamanhos variando entre 200 nm e 2 µm. Cubossomos de PHY foram reproduzidos com sucesso a partir do protocolo escolhido, em meios aquoso, tampão PBS e 2.25% glicerol. SAXS revelou nanopartículas com simetria cristalográfica Pn3m e parâmetro de rede 6.74(04) nm. Por DLS, o tamanho das partículas foi de ~450 nm e polidispersão moderada 0.161(10). Medidas de NTA foram consistentes com DLS, mostrando uma larga distribuição de tamanhos e concentração de partículas ~1016 partículas/mL. MET revelou cubossomos quadrados e mais arredondados de tamanhos variados. Criomicroscopia apresentou partículas com estrutura interna bem definida, tamanhos variados (confirmando a polidispersão) e parâmetro de rede calculado em ~6.5 nm, compatível com medidas de SAXS. Essas amostras também foram submetidas a liofilização e descobriu-se que mesmo depois da re-hidratação, as partículas ainda mantiveram as mesmas características da amostra original. A extrusão também foi feita com o objetivo de melhorar a polidispersão e controlar o tamanho das partículas, novamente, os cubossomos demonstraram manter sua estrutura interna depois desse processo, diminuindo seus tamanhos e diminuindo a polidispersão dos sistema. MILT foi encapsulada de duas formas: passiva (co-solubilização) e ativa (adição depois que as nanopartículas foram formadas). Com até 5% w/w de MILT incorporada, os cubossomos mantiveram sua estrutura cristalográfica, porém em concentrações de 10%, 15% e 20% w/w, o fármaco provocou transição de fase para simetria Im3m. Em baixas concentrações, MILT aumentou os parâmetros de rede dos cubossomos e a hipótese levantada foi que a droga se insere na bicamada lipídica das nanopartículas. DLS revelou que MILT não altera o tamanho das partículas nem sua polidispersão. MET revelou partículas quadradas e arredondadas com tamanhos maiores que os medidos por DLS. Para a amostra 4% w/w, a crio microscopia foi realizada e as partículas encontradas apresentaram estrutura interna e parâmetro de rede calculado ~7 nm, compatível com medidas de SAXS. Co-solubilização e adição depois do preparo se mostraram equivalentes para o encapsulamento da MILT. Todas as amostras também foram submetidas a um estudo de temperaturas para investigar transições de fase, baseando-se nos diagramas de fase dos lipídios. Foi descoberto que os cubossomos, sem a droga, a 65 °C sofrem transição para a fase isotrópica L2 e quando MILT está incorporada essa transição não acontece. DLS também revelou que as partículas não têm seus tamanhos alterados com o aumento de temperatura. Por fim, cubossomos mostraram ser excepcionais conseguindo manter suas características físico-químicas mesmo quando submetidos a ambientes extremos, como a liofilização, a extrusão e a altas temperaturas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18122018-172044 |
| Date | 05 November 2018 |
| Creators | Malheiros, Barbara |
| Contributors | Barbosa, Leandro Ramos Souza |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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