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Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A criptococose é uma micose sistêmica adquirida pela inalação de basidiosporos ou leveduras desidratadas de Cryptococus neoformans e Cryptococus gattii, estas duas espécies podem causar criptococose oportunista e primária respectivamente. C. neoformans está constituído de tipos moleculares VNI-VNIV e C. gattii de VGI-VGIV que apresentam distribuição geográfica diferenciada, como por exemplo, o tipo VNI é cosmopolita e está associado a AIDS e VGI predominando na Austrália e EUA, o tipo VGII predominando no Brasil e America Latina. Este trabalho tem por objetivo realizar estudo comparado dos tipos moleculares VNI de C. neoformans, VGI e VGII de C. gattii analisando diferentes aspectos tais como: 1- Determinar o perfil da suscetibilidade in vitro da concentração inibitória mínima (CIM) de fluconazol (FLZ), itraconazol (ITZ), 5-fluorocitosina (5FC) e anfotericina B (AMB), isoladamente e de forma combinada de AMB com 5FC e AMB com Voriconazol (VRZ); 2- Determinar CIM pela citometria de fluxo (CMF) frente a FLZ, ITZ e AMB; 3- Definir a concentração mínima letal (CML) de AMB e 5FC, isoladamente e em combinação; 4- Avaliar a ação da melanina frente a 5FC e AMB na forma combinada e isolada de 5FC; 5- Induzir a resistência in vitro para FLZ e padronizar os fluorocromos: acetoximetil - calceína (calceina-AM), acetoximetil - 2\2019, 7\2019 -bis-(2-carboxietil)-5-(e -6)- carboxifluoresceína (BCECF-AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3\2019 \2013dipentiloxacarbocianina (DiOC5) na CMF para verificar a expressão de bombas de efluxo; 6- Comparar a expressão de bombas de efluxo
Os resultados permitiram identificar diferentes fenótipos de suscetibilidade que foram analisados e comparados entre as duas espécies e os tipos moleculares, permitindo a produção de quatro artigos; sendo assim, concluímos que: 1- Na análise das CIMs o tipo molecular VGII apresentou-se menos suscetível em relação a VGI e VNI; já na combinação in vitro de AMB e VRZ foi observado 100% de indiferença, e na combinação de AMB e 5FC observou-se necessidade de padronização da concentração da glicose para obter testes que possam ser futuramente relacionados a casos clínicos; 2- O método de CMF demonstrou ser alternativa de leitura automatizada, reprodutível, para os testes de suscetibilidade antifúngica com uso de Laranja de Acridina e FUN-1; 3- Foi verificada a importância da realização do teste da CML para verificar a ação protetora da melanina frente a combinação de AMB e 5FC. 4- A expressão da melanina, na combinação de AMB e 5FC reduz a detecção do sinergismo e o efeito aditivo in vitro. 5. Os isolados induzidos à resistência ao FLZ permitiram obter resultados estatisticamente significativos na verificação de Bombas de efluxo in vitro na CMF com uso de fluorocromo Dioc5 e bloqueador de protonóforos CCCP; 6- Foi verificado que 65% de isolados não induzidos a resistência e 90% de isolados induzidos a resistência do tipo molecular VGII expulsam o FLZ com certa vantagem em relação aos tipos moleculares VGI e VNI. Os resultados deste trabalho contribuem para compreensão do comportamento in vitro de C. neoformans e C. gattii frente a drogas antifúngicas cujos resultados poderão ser aplicados em estudos clínicos de correlação in vitro e in vivo para melhor compreensão da terapêutica antifúngica da criptococose e validação dos testes de suscetibilidade para estas duas espécies / Cryptococcosis is a system
ic mycosis acquired by inhalation of dried yeasts or basidiospores of
Cryptococus
neoformans
and
Cryptococus
gattii
, these species can cause cryptococcosis opportunistic
and primary respectively.
C. neoformans
is composed of molecular types VNI
-
VNIV and
C. gattii
VGI
-
VGIV they have different geographical distribution, the VNI type is cosmopolitan and is
associated with AIDS, VGI type is predominant in Australia and the USA; while VGII type occurs in
Brazil and Latin America. This paper aims to conduct a
comparative study of the molecular types VNI
C. neoformans
and VGI, VGII
C. gattii
analyzing different aspects such as
:
1
–
The susceptibility
profile
in vitro
of fluconazole (
FLZ
), itraconazole ( ITZ ), 5
-
fluorocytosine ( 5FC ) and
amphotericin B ( A
MB ) alone and in combination with 5FC and AMB with voriconazole ( VRZ )
2
–
The minimum inhibitory concentration ( MIC ) by flow cytometry ( FCM ) comparing MIC of
FLZ
,
ITZ and AMB with CLSI;
3
-
The minimum lethal concentration ( MLC ) of AMB and 5FC, a
lone and
in combination;
4
-
The action of melanin against 5FC and AMB alone and combined 5FC,
5
–
The
induced resistance
in vitro
to FLZ and standardize the fluorochromes:
acetoximetil
-
calceína
(calceina
-
AM), acetoximetil
-
2’, 7’
-
bis
-
(2
-
carboxietil)
-
5
-
(e
-
6)
-
carboxifluoresceína (BCECF
-
AM),
rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3’
–
dipentiloxacarbocianina (DiOC5)
in FCM to verify
expression of efflux pumps;
6
-
The compare the expression of efflux pumps. These results permitted
the identification of dif
ferent susceptibility phenotypes which were
analyzed and compared between
the two species and molecular types, allowing the production of four articles
. T
hus, we
concluded that:
1
-
The analysis of the molecular type VGII MICs presented less susceptibility
against VGI and VNI,
whereas in the combination of AMB and VRZ in vitro 100% indifference was observed, in the
combination of AMB and 5FC we observed the need for standardization of the concentration of
glucose for future tests which can be related to cli
nical cases;
2
-
the FCM method proved to be an
alternative automated reproducible reading for antifungal susceptibility testing with use of Acridine
Orange and FUN
-
1,
3
-
The importance of carrying out the MLC test to verify the protective action of
mela
nin when exposed to the combination of AMB and 5FC.
4
-
Was also verified
that expression of
melanin, in combination AMB and 5FC reduces the detection of synergism and additive effect
in vitro
.
5
-
The strains induced to resistance to fluconazole made it p
ossible to obtain statistically significant
results in the verification of acriviry of efflux pumps
in vitro
using FCM with fluorochrome Dioc5 and
protonophores blocker
CCCP,
6
-
It was found that 65% isolates no inducted
to resistance and 90%
isolates ind
ucted to resistance of the molecular ty
pe VGII expels the FLZ
with a certain advantage in
relation to the molecular
types VNI and VGI. The results of these studies contribute to the
understanding of the behavior
in vitro
of
C. neoformans
and
C. gattii
agai
nst antifungal drugs and can
be applied in clinical correlation studies
in vitro
and
in vivo
to better understand the antifungal therapy
of cryptococcosis and validation of susceptibility testing for these two species.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/14376 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Morales, Bernardina Penarrieta |
| Contributors | Bertho, Álvaro Luiz, Wanke, Bodo, Madeira, Maria de Fátima, Pereira, Sandro Antônio, Silva, Simone da Costa Cruz, Paes, Rodrigo de Almeida, Lazéra, Márcia dos Santos, Trilles, Luciana |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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