Cyanobacteria is perhaps the phylum that profit the most from the escalating hypereutrophication of continental waters. The resulting cyanobacterial blooms may accumulate a variety of potent toxins. Cylindrospermopsin (CYN) is a cyanotoxin known for inhibiting protein synthesis, and producing oxidative stress as well as DNA damage in eukaryotic cells. Since the toxin\'s molecular mechanisms and targets are still unclear, we purified the cyanotoxin from our lab strains and employed a shotgun proteomics approach to reveal the major changes in HepG2 cells at sublethal doses of CYN (1 µM for 6, 12 and 24h). Metabolically labeled cells were stimulated and lysed after each treatment, their tryptic digests were separated by nano HPLC and analyzed by high-resolution tandem mass spectrometry (HRMS) on data dependent acquisition mode. We scanned an average of 4000 proteins in every sample throughout the three timepoints. Cholesterol biosynthesis and transport was mostly downregulated throughout the timepooints of the experiment. Downregulation of proteins related to ubiquitination (e.g. UBE2L3) and proteolysis pathways (e.g. PSMA2) was observed in the proteomics dataset, and these results were validated by western blot. Transcription, translation and cell cycle processes showed convoluted regulation dynamics involving known cell cycle regulators like PCNA. Downregulation of mitochondrial enzymes, oxidative stress and damage to the mithochondrial inner membrane was early evidenced after a 6 hrs treatment and validated using a JC-1, a mitochondrial membrane potential probe. The resulting dataset gives us a first glimpse of the protein groups affected at the early stage of CYN cell intoxication. / Cianobactéria é o filo que mais se beneficia da crescente hipereutrofização das águas continentais. As florações de cianobactérias resultantes podem acumular potentes toxinas. A Cilindrospermopsina (CYN) é uma cianotoxina conhecida por inibir a síntese protéica e produzir estresse oxidativo, além de danos ao DNA em células eucarióticas. Os mecanismos moleculares e alvos de toxicidade aguda desta toxina ainda não são claros. Por esse motivo adoptamos uma abordagem de proteômica quantitativa baseada em descoberta para revelar as principais alterações nas células HepG2 em doses subletais de CYN (1 µM para 6, 12 e 24h). As proteinas dos hepatócitos foram marcadas metabolicamente, foram estimuladas com a toxina e os digestos trípticos foram analisados por espectrometria de massa em tandem de alta resolução (HRMS) no modo de aquisição dependente de dados. Escaneamos uma média de 4000 proteínas ao longo dos intervalos de tempo. A biosintese e transporte do colesterol foi inibida durante a maior parte do tratamento com a toxina. Proteínas e enzimas relacionadas com o processo de ubiquitinação (ex. UBE2L3) e proteólise (ex. PSMA2) foram inibidas, e alterações nas proteínas envolvidas nesses processos foram validadas por meio de Western Blot. Os processos de transcrição, tradução e ciclo celular mostraram uma dinâmica de regulação complexa, envolvendo reguladores e disruptores do ciclo celular como por exemplo PCNA. Danos à membrana mitocondrial e evidência de estresse oxidativo foram detectados após 6 horas de tratamento, e essas mudanças no proteoma foram validados por meio do corante JC-1 (test que detecta mudanças no potencial da membrana mitocondrial). O banco de dados resultante nos dá um primeiro vislumbre das proteinas afetados no estágio inicial da intoxicação celular pela CYN.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-19102017-153400 |
| Date | 13 July 2017 |
| Creators | González Blanco, Carlos Andrey |
| Contributors | Pinto, Ernani |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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