Processos fotodinâmicos aplicados a sistemas biológicos têm sido utilizados in vitro e in vivo como uma modalidade terapêutica seletiva e não invasiva em diversas áreas da saúde, incluindo a Medicina Regenerativa. Neste trabalho, propomos o seu estudo na reparação e regeneração tecidual, pela utilização de um fármaco fotossensibilizante associado a um sistema de veiculação e sua ação fotobiológica, monitorada pela atividade celular (sistemas 2D e 3D). Para superar limitações do modelo celular convencional em monocamada, tais como baixa interação célula-célula e célula-matriz extracelular, propomos o uso de modelos tridimensionais de pele (denominados equivalentes dérmicos). Desta forma, algumas condições existentes in vivo podem ser mimetizadas in vitro, conduzindo à observação de um comportamento mais próximo à situação real. Os equivalentes dérmicos foram preparados através do cultivo celular em uma matriz de colágeno tipo I, que foi extraído de tendões da cauda de ratos Wistar. Foram escolhidas duas linhagens celulares para a padronização dos modelos tridimensionais: fibroblastos NIH/3T3 (ATCC® CRL-1658TM) e células-tronco humanas HBMS (Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells, ATCC® PCS-500-012TM). Os ED produzidos foram monitorados por um período de 14 dias para o estudo do perfil de cinética de contração e também observamos a formação da matriz tridimensional de colágeno através da microscopia óptica. O perfil de contração observado é mais acentuado nos primeiros dias e tende a se estabilizar no final do período analisado. Fatores como concentração celular e de colágeno interferem nesta cinética. Estudos de histologia, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal também foram realizados para melhor caracterizar o modelo. Em uma segunda etapa deste trabalho, estudos de fotobiomodulação foram conduzidos nestes modelos celulares, associando-se o uso de fotoprocessos com luz visível de baixa intensidade (doses 70, 140 e 300 mJ/cm2) e o fármaco fotossensibilizante ftalocianina de cloro alumínio (ClAlPc), veiculado em um sistema de liberação nanoestruturado clássico do tipo nanoemulsão. A expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs), enzimas associadas a eventos biológicos de remodelação da matriz extracelular, foi avaliada através da técnica de zimografia. / Photodynamic Process applied to biological systems has been used in vitro and in vivo as selective and noninvasive modality in several areas including Regenerative Medicine. In this research project, we propose to study wound healing and tissue regeneration, induced by the use of a photosensitizer drug into 2D and 3D cellular models. In order to perform experiments with high level of biological complexity, we propose to use three-dimensional tissue models (called dermal equivalents). The aim is to mimic in vitro, the conditions existing in in vivo, such as cell-cell contact and cell-extracellular matrix interactions, which cannot be observed in monolayer cultures. The dermal equivalents were obtained combing fibroblasts cells NIH /3T3 (ATCC® CRL-1658TM) or Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (ATCC® PCS-500-012TM) with collagen matrix. Collagen type I was obtained from tail tendons of Wistar rats. The three-dimensional model was monitored over 14 days and to study the kinetic contraction, the diameter of each disc was measured. Also, the collagen matrix was evaluated by bright field microscopy. The classical profile observed is more pronounced in the early days and tends to stabilize at the end of the period. This kinetic can be modified by the concentration of cells and collagen. Histological analyses, scanning electron microscopy (SEM) and confocal microscopy were also important to describe this model. Second, photobiology tests were performed, combining low-intensity laser (70, 140 e 300 mJ/cm2) and a classical Chloro Aluminum Phthalocyanine photosensitizer drug encapsulated into polymeric nanoemulsion. Matrix metalloproteinases (MMPs) expression in the cell culture was evaluated by zymography. These are endopeptidases associated with wound healing and remodeling processes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04102018-111341 |
| Date | 12 April 2018 |
| Creators | Gehlen, Jaqueline Martins |
| Contributors | Tedesco, Antonio Claudio |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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