Bacterial small RNAs are key mediators of post-transcriptional gene regulation. An increasing number of sRNAs have been implicated in the regulation of virulence programs of pathogenic bacteria. Recently, in the enteric pathogen Salmonella Typhimurium, the PinT sRNA has gained increased importance as it is the most upregulated sRNA as Salmonella infects mammalian host cells (Westermann et al., 2016). PinT acts as a temporal regulator of Salmonella‘s two major pathogenicity islands, SPI-1 and SPI-2 (Kim et al., 2019; Westermann et al., 2016). However, the complete set of PinT targets, its role in Salmonella infection and host response is not yet fully understood. Building on the MS2 affinity purification and RNA- seq (MAPS) method (Lalaouna et al., 2015), we here set out to globally identify direct RNA ligands of PinT, relevant to Salmonella infection. We transferred the classical MAPS technique, based on sRNA-bait overexpression, to more physiological conditions, using endogenous levels of the sRNA. Making the henceforth identified targets, less likely to represent artefacts of the overexpression. More importantly, we progressed the MAPS technique to in vivo settings and by doing so, we were able pull-down bacterial RNA transcripts bound by PinT during macrophage infection. While we validate previously known PinT targets, our integrated data revealed novel virulence relevant target. These included mRNAs for the SPI-2 effector SteC, the PhoQ activator UgtL and the 30S ribosomal protein S22 RpsV. Next, we follow up on SteC, the best characterized virulence relevant PinT target. Using genetic and biochemical assays, we demonstrate that PinT represses steC mRNA by direct base-pairing and translational interference. PinT-mediated regulation of SteC leads to alterations in the host response to Salmonella infection. This regulation impacts the cytokine response of infected macrophages, by altering IL10 production, and possibly driving the macrophages to an anti-inflammatory state, more permise to infection. SteC is responsible for F-actin meshwork rearrangements around the SCV (Poh et al., 2008). Here we demonstrate that PinT-mediated regulation of SteC, impacts the formation of this actin meshwork in infected cells. Our results demonstrate that SteC expression is very tightly regulated by PinT in two layers; indirectly, by repressing ssrB and crp; and directly by binding to steC 5’UTR. PinT contributes to post-transcriptional cross-talk between invasion and intracellular replication programs of Salmonella, by controlling the expression of both SPI-1 and SPI-2 genes (directly and indirectly). Together, our collective data makes PinT the first sRNA in Gram-negatives with a pervasive role in virulence, at the center of Salmonella virulence programs and provide molecular input that could help explain the attenuation of pinT-deficient Salmonella strains in whole animal models of infection. / Kleine RNAs sind zentrale Stellschrauben der posttranskriptionellen Genregulation in Bakterien. Eine zunehmende Anzahl von sRNAs ist an der Regulation von Virulenzprogrammen pathogener Bakterien beteiligt. In jüngster Zeit hat beim enterischen Erreger Salmonella Typhimurium die PinT-sRNA an Bedeutung gewonnen, da sie die am stärksten hochregulierte sRNA während der Infektion von Säugetierwirtszellen ist (Westermann et al., 2016). PinT fungiert als zeitlicher Regulator der beiden wichtigsten Pathogenitätsinseln von Salmonella, SPI-1 und SPI-2 (Kim et al., 2019a; Westermann et al., 2016). Die vollständige Liste der Targets von PinT und die Rolle von PinT bei der Salmonella-Infektion sowie der Wirstantwort sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Mit Hilfe der MS2 affinity purification and RNA-seq (MAPS)-Methode (Lalaouna et al., 2015) möchten wir hier direkte RNA-Liganden von PinT identifizieren, die für die Salmonella-Infektion relevant sind. Wir übertragen die klassische MAPS-Technik, die auf der Überexpression von sRNA-Baits basiert, auf physiologischere Bedingungen unter Verwendung endogener Mengen der sRNA. Dadurch wird die Wahrschienlichkeit, dass die identifizierten Targets Artefakte sind, verringert. Darüber hinaus sind wir in der Lage, die MAPS-Technik unter in vivo-Bedingungen durchzuführen. Auf diese Weise konnten wie bakterielle Transkripte, die während einer Makrophageninfektion an PinT gebunden wurden, isolieren. Während wir bereits bekannte PinT-Ziele validieren, identifizieren unsere integrierten Daten ein neues Target, das für Virulenz relevant ist. Dazu gehörten mRNAs für den SPI-2-Effektor SteC, den PhoQ-Aktivator UgtL und das ribosomale 30S-Protein S22 RpsV. Zunächst untersuchen wir SteC, das am besten charakterisierte virulenzrelevante PinT-Ziel. Anhand genetischer und biochemischer Assays zeigen wir, dass PinT die steC-mRNA durch direkte Basenpaarung und Translationsrepression reguliert. Die PinT-vermittelte Regulation von SteC führt zu einer veränderten Wirtsreaktion auf eine Salmonella-Infektion. Diese Regulation beeinflusst die Zytokinreaktion infizierter Makrophagen, indem sie die IL10-Produktion verändert und die Makrophagen möglicherweise in einen entzündungshemmenden Zustand versetzt, der sie anfälliger für eine Infektion macht. SteC ist verantwortlich für die Umlagerung von F-Actin-Netzen um die SCV (Poh et al., 2008). Hier zeigen wir, dass die PinT-vermittelte Regulation von SteC die Bildung dieses Aktin-Netzwerks in infizierten Zellen beeinflusst. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Regulation der SteC-Expression durch PinT auf zwei Ebenden stattfindet: indirekt durch Unterdrückung von ssrB und crp; und direkt durch Bindung an steC 5’UTR. PinT trägt zum posttranskriptionellen Crosstalk zwischen Invasions- und intrazellulären Replikationsprogrammen von Salmonella bei, indem die Expression von SPI-1- und SPI-2-Genen (direkt und indirekt) gesteuert wird. Insgesamt macht unterstreichen unsere Daten die zentrale Rolle von PinT in Virulenzprogrammen von Salmonella. PinT ist die erste sRNA in Gram-Negativen mit einer derart durchdringenden Rolle bei der Virulenz. Zudem liefern unsere Ergebnisse Einblick auf molekularer Ebene, die die Attenuation von PinT-defizienten Salmonella-Stämmen in Tiermodellen erklären könnte.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:20492 |
| Date | January 2021 |
| Creators | Santos, Sara F. C. |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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