Leucodistrofia metacromática (LDM) é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima arilsulfatase A (ARSA) que afeta primariamente o sistema nervoso central (SNC). Tratamentos em estudos incluem a terapia de reposição enzimática e o transplante de medula óssea, porém com limitações devido à barreira hemato-encefálica (BHE). Uma alternativa seria a implantação no cérebro de células encapsuladas superexpressando ARSA, simulando a reposição enzimática sem injeções repetidas e eliminando a necessidade de transpor a BHE. Baseado nisto, testamos a habilidade de células BHK encapsuladas superexpressando ARSA em corrigir a deficiência enzimática em fibroblastos de pacientes com LDM. Três grupos foram analisados: fibroblastos tratados com células BHK superexpressando ARSA (rBHK) imobilizadas em cápsulas de alginato (grupo CAPSULES), fibroblastos tratados com o sobrenadante de células rBHK não encapsuladas (grupo UPTAKE CONTROL) e fribroblastos tratados com as cápsulas vazias (grupo EMPTY). Fibroblastos não tratados e normais foram usados como controles. As rBHK foram obtidas por seleção clonal após transfecção com o vetor pTARSA-CMV2, por método de transferência gênica não viral. A atividade de ARSA foi medida após 1, 2, 3 e 4 semanas de tratamento, usando ensaio espectrofotométrico. A atividade de beta-gal foi usada como referência. A análise estatística foi realizada usando os testes ANOVA e Tukey post hoc. Fibroblastos normais têm uma atividade de ARSA de 23,9 +/- 2,01 nmol/h/mg prot. Fibroblastos não tratados apresentaram baixos níveis enzimáticos (2,22 +/- 0.17). O grupo EMPTY apresentou os mesmos níveis de ARSA que os fibroblastos não tratados. Os grupos CAPSULES e UPTAKE CONTROL demonstraram altos níveis de ARSA, respectivamente 23,42 +/- 6,39 e 42,35 +/- 5,20 (p<0,01 para todos os grupos), quando comparado aos fibroblastos não tratados. Clones de rBHK encapsulados demostraram um alto potencial como nova estratégia terapêutica no tratamento de LDM, alcançando níveis enzimáticos normais em fibroblastos humanos deficientes. Entretanto, mais estudos devem ser realizados usando modelo animal para corroborar nossos achados. / Metachromatic leukodystrophy (MLD) is an autosomal recessive disorder due to arylsulfatase A (ARSA) deficiency that affects primarily the Central Nervous Systems (CNS). Ongoing treatments include enzyme replacement therapy and bone marrow transplantation, both limited in their effects due to the blood-brain barrier. An alternative would be the implantation in the brain of encapsulated cells over expressing ARSA that would eliminate the need of repeated infusions and overcome the blood brain barrier. Based on that, we tested the ability of encapsulated BHK cells over expressing ARSA to correct enzymatic deficiency in fibroblasts from MLD patients. Three groups were analyzed: fibroblasts treated with ARSA-over expressing BHK cells (rBHK) trapped in alginate capsules (CAPSULES group), fibroblasts treated with supernatant of non-encapsulated rBHK (UPTAKE CONTROL) and fibroblasts treated with empty capsules (EMPTY group). Untreated and normal fibroblasts were used as controls. rBHK were obtained by clone selection after non viral transfection with pTARSA-CMV2. ARSA activity was measured after 1, 2, 3 and 4 weeks of treatment using spectrophotometric assay, and beta-gal was used as reference enzyme. Sattistical analysis was performed using ANOVA and Tukey’s test. Normal group showed an ARSA activity of 23.9 +/- 2.01 nmol/h/mg prot. MLD untrated had the lowest ARSA activity (2.22 +/- 0.17). EMPTY group ARSA activity was equal untreated fibroblasts (2.71 +/- 0.34). CAPSULES and UPTAKE CONTROL groups showed higher enzymatic levels, compared with to the MLD untreated, respectively 23.42 +/- 6.39 and 42.35 +/- 5.20 (p<0,01 for all groups). Encapsulated rBHK clones show potencial as a new therapeutic strategy for the treatment of MLD, reaching a normal enzyme levels in human MLD fibroblasts. However more studies are still needed using MLD animal model to corroborate our findings.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:lume.ufrgs.br:10183/14811 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Lagranha, Valeska Lizzi |
| Contributors | Giugliani, Roberto, Matte, Ursula da Silveira |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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