Titre de l'écran-titre (visionné le 20 mars 2023) / La transducine est une protéine G, composée de trois sous-unités (alpha, $G_α$t; bêta, $G_β$t; gamma, $G_γ$t). La liaison entre la rhodopsine et la $G_{αβγ}$t provoque l'échange du GDP pour le GTP au niveau de la sous-unité $G_α$t, résultant en la dissociation entre les sous-unités $G_α$t et $G_{βγ}$t. Ce projet de recherche est centré sur l'étude des sous-unités $G_β$t et $G_γ$t et du complexe formé par ces deux sous-unités ($G_{βγ}$t), afin de déterminer la stabilité de leur structure individuelle ainsi que celle de l'hétérodimère $G_{βγ}$t. La sous-unité $G_γ$t a été surexprimée dans E. coli en fusion avec deux étiquettes de purification et a ensuite été purifiée par chromatographie d'affinité. L'ADN de la sous-unité $G_β$t a été synthétisé commercialement, individuellement et en fusion avec des étiquettes. Des essais de surexpression de la sous-unité $G_β$t ont été faits dans divers types de cellules hôtes. Toutefois, de faibles quantités de la sous-unité $G_β$t ont été obtenues sous une forme soluble, nécessitant l'utilisation du détergent dodécylsulfate de sodium (SDS) pour optimiser sa production. La sous-unité $G_β$t a ensuite été purifiée en utilisant le même protocole que dans le cas de la sous-unité $G_γ$t. Des travaux ont été faits pour reconstituer l'hétérodimère $G_{βγ}$t en procédant au mélange équimolaire de la sous-unité $G_γ$t purifiée et de la protéine de fusion de la $G_β$t purifiée avec ses étiquettes. Des mesures additionnelles de chromatographie d'exclusion de taille et d'immunobuvardage de type western seront nécessaires pour confirmer la formation de l'hétérodimère $G_{βγ}$t. Des segments externes des bâtonnets ont été purifiés à partir d'yeux bovins afin de purifier la forme farnésylée des sous-unités $G_{βγ}$t pour comparer ses propriétés avec celles de l'hétérodimère $G_{βγ}$t reconstitué. Finalement, ces travaux ont permis de mettre au point un protocole afin de surexprimer et de purifier les sous-unités $G_β$t et $G_γ$t ainsi que pour tenter de former l'hétérodimère $G_{βγ}$t, / Transducin is a G protein composed of three subunits (alpha, $G_α$t; beta, $G_β$t; gamma, $G_γ$t). The binding between rhodopsin and $G_{αβγ}$t causes the exchange of GDP for GTP on the $G_α$t subunit, which results in the dissociation between the $G_α$t and the $G_{βγ}$t subunits. This research project focuses on the study of the $G_α$t and the $G_{βγ}$t subunits as well as the complex formed by these two subunits ($G_{βγ}$t), in order to determine the stability of their individual structure as well as that of the $G_{βγ}$t heterodimer. The $G_γ$t subunit was overexpressed in E. coli in fusion with two purification tags. This subunit was then purified by affinity chromatography.The DNA of the $G_β$t subunit has been synthesized commercially, individually as well as in fusion with purification tags. The $G_β$t subunit has been overexpressed using various types of host cells. However, low amounts of the soluble $G_β$t subunit were obtained, which required the use of the detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) to optimize its production. The $G_β$t subunit was purified using the same protocol as that used for the $G_γ$t subunit. Work has been done to reconstitute the $G_{βγ}$t heterodimer by preparing equimolar mixtures of the $G_γ$t subunit and the $G_β$t fusion protein after their purification. Additional measurements of size-exclusion chromatography and western blot will be necessary to confirm the formation of the $G_{βγ}$t heterodimer.Rod outer segments were purified from from bovine eyes to prepare farnesylated $G_{βγ}$t in order to compare its properties with that of reconstituted $G_{βγ}$t heterodimer. Finally, this research work allowed to develop a protocol in order to overexpress and purify the $G_β$t and $G_γ$t subunits as well as to tentatively reconstitute the $G_{βγ}$t heterodimer.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/113944 |
| Date | 27 March 2023 |
| Creators | Gagnon, Camille |
| Contributors | Salesse, Christian |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Mémoire de maîtrise |
| Format | 1 ressource en ligne (xix, 126 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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