Les génomes bactériens contiennent de nombreuses séquences répétées qui ont un rôle majeur dans la plasticité et l'évolution des génomes. Parmi elles, les séquences REP sont de courtes séquences d'ADN, trouvées en grand nombre dans des régions intergéniques de plusieurs espèces bactériennes. Ces séquences ont la particularité de présenter des structures en tige boucle précédées par un tétranucléotide conservé. Elles peuvent exister seules mais sont majoritairement groupées dans des clusters consécutifs appelés BIME. De nombreux rôles ont été attribués aux REP/BIME dans la physiologie de la cellule : elles sont notamment impliquées dans la régulation de l'expression des gènes et elles constituent des sites de fixation pour plusieurs protéines de l'hôte. Toutefois, leur origine et le mécanisme de leur dissémination dans les génomes ne sont pas connus. Récemment, un gène codant une protéine (TnpAREP) apparentée aux transposases de la famille des séquences d'insertions IS200/IS605 a été identifiée en association avec des REP/BIME au sein de structures appelées REPtron. Il a été alors proposé que les REP/BIME pourraient être des éléments transposables non-autonomes mobilisables par la protéine TnpAREP. Cette protéine fait partie de la superfamille des enzymes HuH comprenant des Relaxases, des protéines Rep des phages/plasmides à réplication en cercle roulant et certaines transposases. Elles utilisent le motif HuH (Histidine - résidu hydrophobe - Histidine) pour coordonner des cofacteurs métalliques ainsi que des résidus tyrosines pour leur activité catalytique. Comme pour les transposases HuH de la famille IS200/IS605, TnpAREP reconnait spécifiquement des substrats ADN simple brin. Elle est active in vitro sur des séquences structurées contenant des REP/BIME sous forme simple brin et celle-ci clive au niveau d'un dinucléotide spécifique. Des données cristallographiques suggèrent que TnpAREP serait monomérique, contrairement aux transposases d'IS200/IS605 qui sont des dimères obligatoires. Cela pose de nombreuses questions sur le site catalytique de l'enzyme ainsi que sur le mécanisme de prolifération des REP/BIME dans les génomes bactériens, d'autant plus qu'aucune activité de TnpAREP n'a été décrite in vivo. Mes premiers résultats portent sur la caractérisation du site catalytique de TnpAREP d'E. coli et ont permis d'exclure la possibilité d'un site catalytique hybride comme dans le cas des protéines Rep de certains plasmides. J'ai pu mettre en évidence une activité in vivo de TnpAREP : son expression sous contrôle d'un promoteur inductible à un effet toxique et induit la réponse SOS chez E. coli. J'ai également développé un test pour cartographier des sites de clivage de TnpAREP in vivo et montré que l'enzyme est capable de cliver les deux brins des plasmides et de l'ADN chromosomique. De plus, une excision d'un BIME a pu être observée dans ces conditions. J'ai aussi construit des souches bactériennes permettant d'étudier l'évolution expérimentale des REP/BIME in vivo dont les résultats sont en cours d'analyse. Enfin, nous avons élargi notre étude à un sous-groupe de TnpAREP associées à un autre type de REP/BIME. Cette analyse comparative nous a permis non seulement de généraliser des propriétés observées avec TnpAREP d'E. coli, mais aussi de révéler des caractéristiques spécifiques de ce sous-groupe. / In spite of their compact size, bacterial genomes carry many repetitive sequences, often important for genome function and evolution. Among them, REPs are short DNA found at high copy number in intergenic regions in many bacterial species. These sequences can form stem-loop structures preceded by a conserved tetranucleotide. They can exist as individual units but also as complex consecutive clusters called BIMEs. REP/BIMEs are known to interact with different proteins and several important roles have been attributed to these sequences in cell physiology. However, their origin and dissemination mechanisms are poorly understood. Recently, a first example of prokaryotic domesticated transposases (TnpAREP) was found associated with REP/BIME sequences in structure called REPtron. REP/BIMEs might represent a special type of non-autonomous transposable element mobilizable by TnpAREP. TnpAREP is member of the HuH enzymes superfamily including Relaxases, Rep proteins of RCR plasmids/ss phages and some transposases. These transposases are fundamentally different from classical transposases. They use HuH motif (Histidine-hydrophobe-Histidine) to coordinate metal cofactor and tyrosine residues (Y) as nucleophile for catalysis. TnpAREP shares certain similarities to Y1 HuH transposases encoded by the IS200/IS605 family which processes only ssDNA substrates. Analysis of E. coli TnpAREP activity in vitro also shown the strict requirement of structured single stranded REP/BIME DNA substrates. Cleavage in vitro occurs at a specific dinucleotide. In contrast to Y1 HuH transposases which are obligatory dimers, E. coli TnpAREP is a monomer as shown by structural studies. Furthermore, TnpAREP activities have never been described in vivo. This raises questions about its catalytic sites and also the way by which it promotes REP/BIME proliferation within their host genomes. The first objective of my PhD was to characterize the TnpAREP catalytic site. My results exclude the possibility of a second catalytic site as observed for REP protein of some plasmid families. Here I show that in vivo, expression of TnpAREP under control of an inducible external promoter is toxic to E. coli cells and induces SOS response, the effect depending on catalytic activity of the protein. I have developed an assay to map TnpAREP cleavage sites in vivo and show that it can cleave both DNA strands on plasmid and bacterial chromosome. In these conditions, an excision of BIME could be observed. I also constructed bacterial strains to perform REP/BIME experimental evolution, results are under analysis. Finally, we are extending our analysis to a subgroup of TnpAREP that are associated with another type of REP/BIME. This comparative analysis not only permitted to generalize some properties observed with E. coli TnpAREP but also revealed some interesting distinct characteristics of this subgroup.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016TOU30201 |
| Date | 18 October 2016 |
| Creators | Corneloup, Alix |
| Contributors | Toulouse 3, Ton-Hoang, Bao, Guynet, Catherine |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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