In der Optogenetik werden genetisch codierbare Photorezeptorproteine in Zellen eingebracht, um spezifische Parameter durch Licht zu kontrollieren. Um den sekundären Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) zugänglich zu machen, haben wir vier neu identifizierte photoaktivierte Adenylatzyklasen untersucht. Die vier Gene stammen aus einem Sulfid oxidierenden Bakterium Beggiatoa und aus einem Amoeboflagellaten Naegleria gruberi. Sie codieren für 350 bis 489 Aminosäuren lange Proteine und enthalten eine Blaulicht wahrnehmende BLUF- (blue light sensors using FAD) und eine Adenylatzyklasedomäne. Zellbasierte Funktionstests in E. coli, Xenopus Oozyten und CHO Zellen sowie die Bestimmung der Adenylatzyklase-Aktivität in vitro zeigen, dass alle vier PACs lichtaktiviert arbeiten. Dabei besitzt die bakterielle PAC (bPAC) das größte Potenzial für eine optogenetische Anwendung, da sie eine hohe Lichtaktivität und ein große Licht-zu-Dunkel-Aktivitätsverhältnis besitzt. Um den Vorteil bPACs gegenüber PACalpha aus Euglena zu demonstrieren, verglichen wir beide PACS in Xenopus Oozyten, in Ratten Neuronen und in Drosophila Fliegen. Gegenüber PACalpha besitzt bPAC eine geringere Aktivität im Dunkeln, eine höhere Lichtsensitivität und einen breiteren dynamischen Bereiche und ist damit für viele Anwendungen die bevorzugte PAC. In einem analytischen Ansatz untersuchten wir die Bedeutung der BLUF-Domänen für die Regulation von bPAC. Nach Entfernen der BLUF-Domänen verblieb nur die inaktive Zyklase. Mutationen innerhalb der BLUF-Domäne, die die Photochemie oder die Signaltransduktion beeinflussten, führten zur Ausbildung eines partiell aktiven Rezeptorgrundzustandes. Dies verdeutlicht die Bedeutung eines intakten Wasserstoffbrückennetzwerkes für die funktionelle Regulation von bPAC. Als Ergenbis einer anwendungsorientierten Optimierung wurden eine bPAC Variante mit reduzierter Dunkelaktivität sowie eine Variante erhalten, die ein stabiles, neutrales Flavinradikal ausbildet. / Optogenetics represents the use of genetically encoded photoreceptor proteins to control specific parameters of cells by light. To particularly access optic control of the second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) we tested the suitability of four newly identified photoactivated adenylyl cyclases (PAC). Their genes originate from a soil bacterium Beggiatoa sp. and from an amoeboflagellate Naegleria gruberi. They code for 350 to 489 aa small proteins consisting of one blue light sensing BLUF (blue light sensors using FAD) and one adenylyl cyclase domain. Cell based functional assays in E. coli, Xenopus oocytes and CHO cells as well as in vitro analysis of recombinant protein reveal that all four PACs are light activated adenylyl cyclases. Moreover the bacterial PAC (bPAC) has the highest potential for an optogenetic application due to its high activity in light and low activity in the dark. To demonstrate the advantage of bPAC over the established Euglena PACalpha we compared both proteins in Xenopus oocytes, rat neurons and Drosophila fruit flies. It appears that bPAC features a lower activity in the dark, a higher light sensitivity and a broader dynamic range. Therefore bPAC is the superior optogenetic tool for many applications. In an analytical approach we investigated the impact of the BLUF domains on regulation of the cyclase. Removal of the BLUF domains left the bPAC cyclase in an inactive state. Mutating BLUF residues, which are involved either in photochemistry or signal transduction, resulted in a partially active dark state and reduced light activation of bPAC. Thus the integrity of the BLUF domain hydrogen bond network is essential for functional regulation of bPAC. As a result from application oriented optimization a bPAC variant with reduced dark activity as well as a variant that forms a stable neutral flavin radical was obtained.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/17477 |
| Date | 30 September 2013 |
| Creators | Stierl, Manuela |
| Contributors | Hegemann, P., Gärtner, W., Bartl, F. |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung - Keine Bearbeitung, http://creativecommons.org/licenses/by-nd/3.0/de/ |
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