A clonagem por transferência de núcleo de células somáticas (SCNT) em bovinos é uma biotécnica ineficiente, porém é uma ferramenta muito importante para pesquisas em biologia do desenvolvimento. Estudos prévios em nosso laboratório identificaram três fenótipos gestacionais de clones bovinos produzidos por SCNT: (1) gestação normal (CNG) - presença do embrião (EP), vesícula embrionária (VE) e corpo lúteo ativo (CL); (2) gestação anembrionada (CAG) - presença da VE e CL ativo e ausência de EP; (3) receptoras com CL ativo persistente sem a presença de EP e VE (CPCL). Vacas doadoras de embriões foram sincronizadas pelo protocolo de super-ovulação (SOV) e inseminadas artificialmente, os embriões obtidos após sete dias da ovulação foram transferidos para receptoras que ao ficarem gestantes formaram o grupo controle (GC). O objetivou do estudo foi investigar as características morfovasculares do útero nestes quatro fenótipos gestacionais. A hipótese central foi que as características morfovasculares do útero são moduladas diferentemente nos três fenótipos gestacionais de embriões clonados por SCNT e gestação controle. Vacas Nelores foram sincronizadas e utilizadas como receptoras de embriões. Coletas de sangue para análise de progesterona e exames ultrassonográficos nos modos B e Doppler para análise da morfologia e vascularização uterina foram realizados a cada dois dias a partir do dia 6 até o dia 30 pós-ovulação. Entre os dias 31 e 36, as receptoras foram abatidas e o útero coletado para análises in situ. A simetria entre cornos, o grau de desenvolvimento de carúnculas e da VE foram mensurados e amostras endometriais coletadas para quantificação relativa do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seu receptor do tipo 2 (VEGF-R2) por western-blotting. No total foram realizadas 212 sincronizações do ciclo estral, das quais 79 receptoras receberam embriões de clones por SCNT e 49 receberam embriões produzidos in vivo. Aos 25 dias pós-ovulação as taxas de concepção por grupo foram: CNG = 15,1% (12/79), CAG = 2,5% (2/79), CPCL = 8,8% (7/79) e CG = 24,4% (10/49). Duas receptoras da raça Tabapuã (Bos taurus indicus) do fenótipo do grupo CAG provindas de outro experimento foram incluídas nas análises. Algumas receptoras foram excluídas do experimento devido a perdas gestacionais ocorridas antes do momento do abate, restando para as análises sete receptoras no grupo CNG, três no CAG, quatro no CPCL e nove no CG. Somente o grupo CG apresentou diferença de perfusão vascular entre os cornos uterinos ipso e contralateral (P<0,05). Em relação ao corno ipsolateral, os grupos CG e CNG apresentaram maior perfusão vascular em relação ao grupo CPCL do dia 24 ao 30 (P<0,05). Porém, com a média dos escores da perfusão vascular endometrial de ambos os cornos, o grupo CNG apresentou maiores valores em relação aos grupos CAG e CPCL nos dias 24 e 30. Os índices de resistência vascular (RI) nas artérias uterinas confirmaram os dados subjetivos de diferença de perfusão vascular entre cornos, o corno ipsolateral do grupo CG apresentou menor RI em relação ao contralateral nos dias 22, 24, 28 e 30 (P<0,05) e os grupos CNG e CPCL não apresentaram diferença entre cornos (P>0,05). Entre os grupos, o RI no CG e CAG foi menor que no CPCL no dia 30 (P<0,05). A concentração de progesterona (P4) sanguínea foi menor no grupo CPCL em relação aos grupos CG e CNG nos dias 18 e 26 (P<0,05). A P4 atingiu valores próximos de 8 ng/ml a partir do dia 22 nos grupos CG e CNG, sendo que no grupo CPCL os valores foram inferiores à 6 ng/ml a partir do dia 14. As análises in situ revelaram maior frequência de assimetria de cornos uterinos no grupo CG em relação aos grupos CNG, CAG e CPCL; o grupo CNG obteve maior frequência de ocorrência de carúnculas e VE desenvolvidas nos dois cornos uterinos em relação aos grupos CAG e CPCL (P<0,05), não diferindo do grupo CG (P>0,05). O comprimento dos embriões do grupo CNG foi maior que dos embriões do grupo CG (P<0,05), entre os dias 28 e 34. Não foi detectada diferença de abundância relativa das proteínas VEGF e VEGF-R2 entre os quatro grupos estudados, porém quando os grupos de gestações normais (CG e CNG) foram comparados com os grupos de gestações alteradas (CAG e CPCL) foi detectada maior abundância relativa para o fragmento de 75 kDa da proteína do VEGF-R2 no grupo de gestações alteradas. A hipótese central do estudo, que afirma que as alterações morfovasculares do útero gestante durante o primeiro mês são moduladas em diferentes graus de forma dependente à qualidade de desenvolvimento do concepto foi confirmada. Por fim, este estudo proporcionou um melhor entendimento da fisiologia endócrina, morfológica e vascular das gestações normais e alteradas de embriões clonados por SCNT durante o primeiro mês gestacional, fornecendo base para novos estudos sobre o desenvolvimento e manutenção da gestação inicial em bovinos. / Cloning by nuclear transfer of somatic cells (SCNT) in cattle is an inefficient biotechnique. However, it is a very important tool for research in developmental biology. Previous studies from our lab have identified three gestational phenotypes of bovine clones: (1) Clone normal gestation (CNG) - presence of embryo (EP = embryo proper), embryonic vesicle (EV) and corpus luteum (CL); (2) Clone anembryonic gestation (CAG) - presence of EV and CL and no EP; (3) Recipient presenting only a persistent CL (CPCL). Embryo donor cows were synchronized by superovulation protocol (SOV) and artificially inseminated, embryos obtained after seven days of ovulation were transferred to the control group (CG). This study aimed to investigate whether modulation of the morphological and vascular abnormalities of the uterus by the presence of the cloned conceptus is different between the three gestational clone phenotypes and control. The central hypothesis was that the morphovascular characteristics of the uterus are modulated differently in the three gestational phenotypes of embryos cloned by SCNT and control gestation. Nellore cows were synchronized and used as embryo recipients. Blood collections for progesterone analysis and ultrasound examinations in B and Doppler modes for analysis of uterine morphology and vascularization were performed every two days from day 6 to day 30. Between 31-36 days, the recipients were slaughtered and the uteri were collected for in situ analyzes. The symmetry between horns, the degree of caruncle and EV development were measured and endometrial samples were collected for relative quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor type 2 (VEGF-R2) by western blotting. A total of 212 estrous cycle synchronizations were performed, 79 recipients cows received clone embryos by SCNT and 49 embryos produced in vivo. At 25 days after ovulation the conception rates by group were: CNG = 15.1% (12/79), CAG = 2.5% (2/79), CPCL = 8.8% (7/79), and CG = 24.4% (10/49). Two pregnant cows Tabapuã (Bos taurus indicus) of CAG phenotype from another experiment were included in the analyzes. Some recipients were excluded from the experiment due to gestational losses occurring before the time of slaughter, remaining seven recipients in CNG group, three in CAG, four in CPCL and nine in CG. Only the CG group had a difference in vascular perfusion between the ipso and contralateral uterine horns (P<0.05). In relation to the ipsilateral horn, the CG and CNG groups presented higher vascular perfusion compared to the CPCL group from day 24 to 30 (P<0.05). However, with the average of endometrial vascular perfusion scores of both uterine horns, the CNG group presented higher values in compared to the CAG and CPCL groups on days 24 and 30. The vascular resistance index (RI) of the uterine arteries confirmed the subjective data of vascular perfusion between horns. The ipsilateral horn of the CG group presented lower RI in compared to the contralateral on days 22, 24, 28 and 30 (P<0, 05) and the CNG and CPCL groups did not show this difference between horns (P>0.05). Among groups, the RI in CG and CAG was lower than in the CPCL on day 30 (P<0.05). The blood progesterone (P4) concentration was lower in the CPCL group than in the CG and CNG groups on days 18 and 26 (P<0.05). P4 reached values close to 8 ng/ml after day 22 in the CG and CNG groups, and in the CPCL group the values were lower than 6 ng/ml after day 14. In situ analyzes revealed a higher frequency of uterine horn asymmetry in the CG group compared to the CNG, CAG and CPCL groups; the CNG group had a higher frequency of caruncles and EV development in the two uterine horns compared to the CAG and CPCL groups (P<0.05), not differing from the CG group (P>0.05). The length of the embryos of the CNG group was higher than that of the embryos of the CG group (P<0.05) between days 28 to 34. No difference was detected in the relative abundance of VEGF and VEGF-R2 proteins among the four groups, but when the normal gestation groups (CG and CNG) were compared with the altered pregnancies groups (CAG and CPCL) a greater relative abundance was detected for the 75 kDa fragment of the VEGF-R2 protein in the group of altered pregnancies. The central hypothesis of the study, which states that the morphovascular changes of the pregnant uterus during the first month are modulated in different degrees depending on the quality of development of the concept was confirmed. Finally, this study provided a better understanding of the endocrine, morphological and vascular physiology of normal and altered embryos of cloning by SCNT during the first gestational month, providing a basis for new studies on the development and maintenance of initial gestation in cattle.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-20112017-150425 |
| Date | 19 July 2017 |
| Creators | Marcelo de Luna Freire Oliveira |
| Contributors | Luciano Andrade Silva, Paulo Fantinato Neto, Felipe Perecin, Guilherme Pugliesi |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Biociência Animal, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0034 seconds