Streptococcus mutans é considerado um agente etiológico primário da cárie dentária e um importante agente etiológico da endocardite infecciosa. O microrganismo pode ser classificado em quatro sorotipos (c, e, f e k), sendo o sorotipo c o mais comumente prevalente na população. S. mutans também pode acessar a corrente sanguínea e colonizar células endoteliais das artérias coronárias, através de sua ligação e posterior invasão. O gene cnm, codificador de uma proteína de ligação ao colágeno encontrado em algumas cepas de S. mutans pode ser relacionado com sua virulência. Objetivos: (1) formação de biofilmes em superfícies tratadas com colagénio e a expressão de genes a formação de biofilme chave spaP e brpA, (2) aderência (30 min e 2 h) , invasão (5h) e persistência (24h) em células endoteliais e (3) desmineralização da dentina. Tanto os experimentos de formação de biofilme dependente de colágeno quanto os de aderência, invasão e persistência em células primárias Human Coronary Artery Endothelial Cells foram realizadas utilizando cepas de S. mutans UA159 (sorotipo c), B14 (sorotipo e), OM50E (sorotipo e), LM7 (sorotipo e), OMZ175 (sorotipo f), NCTC 11060 (sorotipo f) e os isolados clínicos deste estudo 7,1 (sorotipo c), C2A4 (sorotipo e) e 61 (sorotipo k). Mutantes deletérios do gene cnm foram construídas em todas as cepas cnm positivas, exceto para C2A4. Cepas OMZ175 e 61 e seus respectivos mutantes também foram empregados para avaliar a expressão de genes spaP e brpA por PCR em Tempo Real e a desmineralização da dentina através de Tomografia de Coerência Óptica (OCT). Os dados mostraram que o gene cnm é significativo para a formação de biofilme em superfícies tratadas com colágeno e invasão de células endoteliais, mas não apresenta influência na adesão celular. A maior parte das cepas cnm positivas foram capazes de persistir intra-celular 24h. O modelo de cárie experimental não foi capaz de demonstrar a importância do gene cnm na desmineralização da dentina. O gene cnm foi necessário para o desenvolvimento de biofilme de e invasão do microrganismo à células endoteliais, mas não para a adesão às HCAEC. / Streptococcus mutans is considered a primary etiological agent of dental caries and an important etiological agent of infectious endocarditis. It can be classified into four serotypes (c, e, f and k), which serotype c is the most commonly prevalent in the population. The recent breakthrough that the cnm gene, which encodes a collagen binding protein found in some S. mutans strains, has set off new studies on this species, such as biofilm formation and bacteria-cell interactions. Aims: (1) biofilm formation on collagen-treated surfaces and the expression of biofilm formation key genes spaP and brpA; (2) adhesion (30 min and 2h), invasion (5h) and persistence (24h) in endothelial cells and (3) dentin demineralization. Experiments on collagen-dependent biofilm formation, and adhesion, invasion and persistence in HCAEC cells (primary Human Coronary Artery Endothelial Cells) were performed using S. mutans strains UA159 (serotype c), B14 (serotype e), OM50E (serotype e), LM7 (serotype e), OMZ175 (serotype f), NCTC 11060 (serotype f) and the clinical isolates of this study 7.1 (serotype c), C2A4 (serotype e) and 61 (serotype k). Mutants cnm were constructed in all strains presenting the gene, except for C2A4. Strains OMZ175 and 61 and their respective mutants were also employed to evaluate both the expression of spaP and brpA genes by PCR Real Time and the dentin demineralization through Optical Coherence Tomography (OCT). One hundred forty four clinical isolates of S. mutans were collected from 47 patients. Our data have shown that the cnm gene is significant for both biofilm formation on collagen-treated surfaces and invasion of endothelial cells, but it has no influence in cell adhesion. In addition, most of the cnm positive strains were able to persist up to 24h intracellularly. Likewise, the model of experimental caries was not able to demonstrate the importance of cnm in dentin demineralization. Thus, gene cnm is required for S. mutans on collagen-dependent biofilm formation and invasion of endothelial cells, but it was not required for adhesion to HCAEC.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-19042013-110450 |
| Date | 10 December 2012 |
| Creators | Siriani, Luciana Kfouri |
| Contributors | Simionato, Maria Regina Lorenzetti |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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