Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été
caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire.
Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire
détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME.
Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation
différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues
pharmacologiques. / Recently several G protein-coupled receptors (GPCRs) have been shown to localize to intracellular membranes, in particular the nuclear membrane. As such, we sought to determine if the β-adrenergic receptor (βAR) subtypes and their associated signalling machinery are functionally localized to nuclear membranes. We demonstrated the presence of β1AR and the β3AR, but not the β2AR, in adult ventricular myocyte nuclei by western blotting, confocal microscopy and functional assays. Downstream signalling partners such as GαS, Gαi and adenylyl cyclase II and V/VI were also present. Nuclear-localized βARs were functional with respect to ligand binding and effector activation. In isolated nuclei, the non-selective βAR agonist isoproterenol (ISO) and the β3AR-selective ligand BRL37344, but not the β1AR-selective xamoterol, stimulated
transcription initiation in a pertussis toxin (PTX)-sensitive manner. In contrast, stimulation of type B endothelin receptors (ETB), another GPCR family shown to be
present on the nuclear membrane, decreased de novo RNA synthesis. To investigate the signalling pathway(s) involved in GPCR-mediated regulation of RNA synthesis, nuclei were isolated from intact adult rat hearts and treated with receptor agonists in the
presence or absence of inhibitors of the PI3K/PKB and mitogen-activated protein kinase
(MAPK) pathways. Components of p38, JNK, and ERK1/2 MAPK cascades as well as
PKB were detected in nuclear preparations. Inhibition of PKB with triciribine converted
the activation of the βAR from stimulatory to inhibitory with regards to transcription
initiation. Analysis by qPCR indicated isoproterenol treatment increased 18S rRNA but
decreased NFκB mRNA. In contrast, ET-1 had no effect on 18S rRNA expression.
Further investigation using pathway-specific PCR arrays revealed that isoproterenol
treatment also reduced the expression of several other genes involved in the activation
of NFκB and that ERK1/2 and PKB inhibitors attenuated this effect. Subsequent
genome-wide microarray analysis has revealed that nuclear βAR and ETB regulated a
host of genes in an overlapping but distinct manner. Moreover, both ET-1 and ISO
produced an L-NAME-sensitive increase in NO production in isolated cardiac nuclei.
These observations were confirmed in intact cardiomyocytes using novel caged
analogues of ISO and ET-1 and the cell-permable NO-sensitive fluorescent dye, DAF-2
DA. Briefly, both ET-1 and isoproterenol increased NO production, and this increase
was prevented upon preincubation with L-NAME. Moreover, the ability of isoproterenol
to increase transcription initiation in isolated nuclei was blocked by L-NAME or the
PKG inhibitor KT5823, indicating the NO-GC-PKG pathway is involved in the
regulation of gene expression by nuclear βARs. Hence, we have shown that βARs and
ETRs in the nuclear membrane activate distinct signalling pathways, resulting in
different effects on gene transcription and thus represent potentially important targets
for drug development.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMU.1866/10110 |
| Date | 09 1900 |
| Creators | Vaniotis, George |
| Contributors | Allen, Bruce, Hebert, Terence |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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