Increased incidences of toxigenic cyanobacterial blooms in freshwater bodies pose significant threats to human and ecosystem health worldwide. Microcystins (MCs), produced mostly by Microcystis, Anabaena, and Planktothrix spp., are amongst the most prevalent freshwater cyanotoxins. Characterization of toxigenic blooms by conventional microscopy is often challenging because of co-occurrence of morphologically indistinguishable toxic and non-toxic strains of cyanobacteria. This research project therefore sought to develop and evaluate polymerase chain reaction (PCR) approaches for improved monitoring of toxigenic cyanobacteria in Canadian freshwater lakes. Preliminary studies evaluating the utility of a suite of microcystin synthetase (mcy) genes for quantitative PCR-based detection of microcystin-producing Microcystis revealed that assays targeting portions of the mcyA, mcyE, and mcyG genes successfully estimated potential microcystin-producing Microcystis genotypes in water samples collected from Baie Missisquoi (Missisquoi Bay), Quebec. The qPCR-based Microcystis mcyA, mcyE, or mcyG toxigenic cell equivalents showed significant associations (p<0.05; R2>0.90) with total Microcystis counts determined by microscopy. Furthermore, all three assays successfully quantified potentially toxic Microcystis cells in samples with undetectable microcystin concentrations, suggesting their potential usefulness in early warning systems for toxigenic cyanobacteria. To further ascertain the utility of developed molecular assays in estimating toxigenic Microcystis concentrations, laboratory studies were conducted to investigate how mcy gene concentrations and biomass of mixed assemblages of a toxic Microcystis sp. and non-toxic Anabaena sp. varied under different nitrogen, phosphorus, temperature, and light regimes. Results demonstrated dependence of growth rates, microcystin cellular and mcyE gene quotas not only on nutrients and temperature conditions, but also the presence of competing cyanobacteria. The fact that changes in mcyE copies often mirrored changes in M. aeruginosa CPCC 299 cellular growth rates implied possible coupling of mcyE production to cellular growth; thus validating use of mcyE gene concentrations as indicators of toxigenic Microcystis.The third phase of this study involved development and utilization of a multiplex qPCR approach for simultaneous quantification of microcystin-producing Anabaena, Microcystis, and Planktothrix genotypes in Missisquoi Bay. Laboratory evaluation showed the multiplex assay to be highly sensitive and specific for mcyE-containing Anabaena, Microcystis, and Planktothrix genotypes, with assay standards achieving R2 values above 0.99 and reaction efficiencies greater than 90%. Analyses of water samples from Missisquoi Bay showed Microcystis spp. as the main putative microcystin producer, with patchy occurrence of toxigenic Anabaena and Planktothrix genotypes during the 2010 and 2011 sampling periods.Finally, the developed qPCR assays were utilized to study Microcystis and Planktothrix mcyE gene expression, concomitantly with changes in mcyE copies, cyanobacterial biomass and MC concentrations, in order to derive the most reliable indicator of microcystin risk. McyE transcripts were generally lower in mixed cultures relative to monocultures, in agreement with depressed growth recorded in the mixed cultures. Whereas concentrations of mcyE gene copies, cell counts, and chl-a correlated significantly (p<0.01) with microcystins in laboratory cultures, McyE gene transcripts levels associated very poorly with MC. Furthermore, mcyE copies showed the strongest positive association with MCs in field samples, suggesting that mcyE copies are better indicators of MC risks rather than McyE transcripts or traditional biomass proxies. / L'occurrence très fréquente d'efflorescences en eau douce constitue une importante menace à la santé humaine et environnementale. Les microcystines sont les cyanotoxines les plus communes et la caractérisation microscopique d'efflorescences toxigènes pose souvent un défi. Ce projet de recherche vise à développer et évaluer des approches axées sur l'amplification en chaîne par polymérase (ACP) pour améliorer le suivi des cyanobactéries toxigènes dans les lacs d'eau douce du Canada. Des études préliminaires évaluant l'utilité, dans la détection quantitative par ACP (qACP) de souches de Microcystis actives ou inactives en production de microcystine, d'une série de gènes codant pour les sous-unités de la microcystine synthétase (mcy), démontra que les tests visant l'identification d'une portion des gènes mcyA, mcyE, ou mcyG permit l'estimation de la quantité de souches de Microcystis toxigènes dans des échantillons d'eau de la Baie Missisquoi, Québec. Les équivalents en cellules de Microcystis toxigènes pour les gènes mcyA, mcyE, ou mcyG furent fortement associés (p<0.05; R2>0.90) au compte total de Microcystis obtenu par microscopie. De plus, les trois tests réussirent à quantifier les cellules de Microcystis ayant le potentiel d'être toxigènes dans des échantillons ayant une teneur en microcystine indétectable, laissant présager leur utilité potentielle dans un système d'alerte précoce pour les cyanobactéries toxigènes. Afin d'évaluer l'utilité des tests moléculaires élaborés pour estimer la teneur en Microcystis toxigènes, des études en laboratoire furent entreprises afin d'évaluer comment la teneur en gènes mcy et la biomasse de différents assemblages mixtes d'une espèce toxigène de Microcystis et d'une espèce non-toxigène d'Anabaena pourraient varier sous divers régimes d'azote, de phosphore, de température et de lumière. Les résultats démontrent une dépendance des taux de croissance, quotas en microcystine cellulaire et gène mcyE sur les nutriments et conditions de température et sur la présence de cyanobactéries compétitrices. Les changements dans le nombre de copies de mcyE furent souvent le reflet du taux de croissance de M. aeruginosa CPCC 299, ce qui implique un jumelage entre la production de mcyE et la croissance cellulaire.L'étude développa et adopta une approche qACP multiplexe pour la quantification simultanée des génotypes d'Anabaena, Microcystis, et Planktothrix produisant de la microcystine dans la Baie Missisquoi. En laboratoire, le test multiplex s'avéra très sensible et spécifique aux souches d'Anabaena, Microcystis, et Planktothrix portant le gène mcyE. Les valeurs de R2 pour la courbe d'étalonnage excédèrent 0.99, et les efficacités de réaction excédèrent 90%. L'analyse des échantillons souligna que Microcystis spp. était le principal présumé producteur de microcystine durant les périodes d'échantillonnage de 2010 et 2011. Enfin, les tests qACP développés servirent à l'étude de l'expression génique de mcyE dans Microcystis et Planktothrix, en parallèle au changement du nombre de copies de mcyE, la biomasse cyanobactérienne et les concentrations en microcystine, afin d'en dériver un indicateur fiable du risque associé à la microcystine. Les produits de transcription de mcyE furent généralement moins élevés dans les cultures mixtes (vs. monocultures), ce qui s'accorde avec la diminution du taux de croissance en cultures mixtes. Lorsque, en cultures maintenues en laboratoire, les concentrations en copies du gène mcyE, le nombre de cellules, et la teneur en chlorophylle a étaient significativement corrélés (p<0.01) avec la teneur en microcystine, le niveau de transcriptions du gène mcyE s'avéra faiblement corrélé au niveau de microcystine. Dans les échantillons, le nombre de copies de mcyE montra une forte association à la teneur en microcystine, suggérant que le nombre de copies de mcyE pourrait être un meilleur indicateur du risque de contamination en microcystine.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119492 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Felexce, Fru Ngwa |
| Contributors | Chandra A Madramootoo (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Bioresource Engineering) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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