Objetivos El objetivo general de esta Tesis Doctoral se centró en la aplicación de la tecnología enzimática para el diseño y optimización de procesos integrados de sacarificación de celulosa mediante el uso de la tecnología de líquidos iónicos y reactores de membrana. Metodología Para llevar a cabo este objetivo se realizaron tests de actividad y estabilidad del derivado enzimático inmovilizado de estudio en diferentes líquidos iónicos (ILs). En los procesos de disolución, regeneración de celulosa y recuperación del IL, se emplearon diferentes etapas de operación (mezclado, filtración y destilación) para la obtención de la celulosa regenerada y separación del IL. Se contempló también, el diseño de sistemas integrados de reacción / separación basados en la incorporación de membranas para la recuperación y reutilización de enzimas. Y por último, para los controles de calidad de las disoluciones de glucosa obtenidas, se emplearon cultivos de Saccharomyces cerevisiae. Resultados y conclusiones La estabilidad de la celulasa comercial (Celluclast®), inmovilizada en un soporte polimérico (Amberlite XAD4), se estudió en 3 líquidos iónicos diferentes [N1114] [NTf2], [Bmim] [NTf2] y [Bmim][Cl]) a 50°C. Los ILs hidrofóbicos mejoraron claramente la estabilidad térmica de la enzima: En el caso del [N1114][NTf2] se consiguió aumentar hasta 4 veces el tiempo de vida media del biocatalizador, mientras que el [Bmim][Cl] se comportó como un potente desactivador. La estabilidad de la celulasa en mezclas IL hidrofóbico/ Bmim][Cl] permitió estabilizar la enzima frente a la desactivación producida por el [Bmim][Cl]. El derivado enzimático inmovilizado se recubrió con [N1114][NTf2] utilizándose exitosamente en la sacarificación de celulosa disuelta en [Bmim][Cl] (i.e. hasta un 50% de hidrólisis en 24h) a 50°C. Así mismo, se desarrolló un proceso cíclico sostenible de sacarificación enzimática de celulosa pretratada con IL. Para ello se emplearon diferente soluciones homogéneas de celulosa en [Bmim][Cl] para la producción de celulosa amorfa mediante precipitación con agua, etanol o una mezcla equimolar agua / etanol. Varios parámetros de operación (e.g. tipo de disolvente, temperatura, ultrasonidos, etc.) se probaron para la precipitación de celulosa así como para las siguientes etapas de lavado para la total recuperación del IL (hasta un 99.7%), el cual se reusó exitosamente en un proceso cíclico de disolución / regeneración. La celulosa regenerada producida en cada ciclo resultó en un sustrato excelente para la sacarificación enzimática (i.e. hasta un 97.7% de hidrólisis en 4h a 50°C) mediante la acción combinada de celulasa y celobiasa solubles. La solución transparente de glucosa obtenida fue de excelente calidad para el crecimiento aeróbico de Saccharomyces cerevisiae. El uso de un reactor de membrana polietersulfónica, en modo discontinuo demostró excelentes rendimientos de hidrólisis (95%), manteniéndose constantes durante 9 ciclos operacionales de reutilización de la enzima soluble, sin problemas de colmatación en la membrana. Por otra parte, la sacarificación en continuo de celulosa, realizada en un reactor de membrana cerámica, requirió la optimización de parámetros como la concentración del sustrato alimentado y el tiempo de residencia en el reactor. Los perfiles de hidrólisis constantes observados durante el estado estacionario del reactor demostraron la idoneidad del mismo. En lo referente a los flujos de permeado, éstos permanecieron constantes en el tiempo, probando una eficaz acción catalítica de la enzima que evitó problemas de colmatación en la membrana. Esta Tesis Doctoral presenta por primera vez una estrategia sostenible para la sacarificación de celulosa en reactores de membrana, basada en la combinación de la tecnología de los líquidos iónicos con la tecnología enzimática, lo que permite la valorización de biomasa vegetal para la producción de bioetanol. / Aims The principal aim of this PhD Thesis was focused on the application of enzyme technology for the design and optimization of integrated processes for saccharification of cellulose using ionic liquids technology and membrane reactors. Methodology To accomplish this aim, activity and stability tests of the studied immobilized enzyme derivative were performed in different ionic liquids (ILs). Different stages of operation (mixing, filtration and distillation) were used in the dissolving, regeneration and recovery of IL processes, in order to obtain regenerated cellulose and separate the IL. The design of integrated reaction / separation systems, based on the incorporation of membranes for the recovery and reuse of enzyme, was also considered. Finally, for quality control of the glucose solutions obtained, cultures of Saccharomyces cerevisiae were used. Results and discussion The stability of commercial cellulase (Celluclast ®), immobilized on a polymer support (Amberlite XAD4) was studied in three different ionic liquids [N1114] [NTf2], [Bmim] [NTf2] and [Bmim] [Cl]) at 50 °C. The hydrophobic ILs clearly improved the thermal stability of the enzyme. For the case of [N1114] [NTf2], the half-life time of the biocatalyst was increase up to 4 times, while [Bmim][Cl] behaved as a powerful deactivating agent. Cellulase stability in mixtures hydrophobic IL / [Bmim][Cl] helped to stabilize the enzyme against inactivation produced by the [Bmim][Cl]. The immobilized enzyme derivative was coated with [N1114] [NTf2] being successfully used in the saccharification of cellulose dissolved in [Bmim] [Cl] (i.e. up to 50% hydrolysis in 24 hours) at 50 ° C. A sustainable cyclic process for enzymatic saccharification of cellulose pretreated with IL was developed. To this end, different homogeneous solutions of cellulose in [Bmim][Cl] were used for the production of amorphous cellulose by precipitation with water, ethanol or an equimolar mixture water/ethanol. Several operating parameters (e.g. type of solvent, temperature, ultrasound, etc.) were tested for the precipitation of cellulose as well as for the following washing steps for the complete recovery of IL (up to 99.7%), which was successfully reused in a cyclic process of dissolution/regeneration. Regenerated cellulose obtained from each cycle was an excellent substrate for enzymatic saccharification (i.e. up to 97.7% hydrolysis in 4 h at 50 ° C) by the combined action of soluble cellulase and cellobiase. The clear solution of glucose obtained was of excellent quality for aerobic growth of Saccharomyces cerevisiae. Enzymatic hydrolysis of cellulose was also studied in different membrane reactors in continuous and discontinuous mode. The use of polietersulfonic membranes in discontinuous mode showed excellent hydrolysis yields (95%), which remained constant for 9 cycles of soluble enzyme reuse, without fouling problems in the membrane. On the other hand, the continuous saccharification of cellulose, realized with a ceramic membrane reactor, required to optimize parameters such as feeding substrate concentration and residence time. Constant hydrolysis profiles observed during the steady state of the reactor demonstrated its suitability. Regarding the flow of permeate, it remained constant along time, confirming an effective catalytic action of enzymes which avoided any fouling problem in the membrane. This PhD thesis presents for the first time a sustainable strategy for the saccharification of cellulose in membrane reactors, based on the combination of the technology of ionic liquids with enzyme technology, which allows the use of plant biomass for production of bioethanol.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UM/oai:www.tdx.cat:10803/120446 |
| Date | 23 July 2013 |
| Creators | Bernal Juárez, Berenice |
| Contributors | Lozano Rodríguez, Pedro, Belleville, Marie-Pierre, Universidad de Murcia. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular B e Inmunología |
| Publisher | Universidad de Murcia |
| Source Sets | Universidad de Murcia |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 191 p., application/pdf |
| Source | TDR (Tesis Doctorales en Red) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTENCIA. El acceso a los contenidos de esta tesis doctoral y su utilización debe respetar los derechos de la persona autora. Puede ser utilizada para consulta o estudio personal, así como en actividades o materiales de investigación y docencia en los términos establecidos en el art. 32 del Texto Refundido de la Ley de Propiedad Intelectual (RDL 1/1996). Para otros usos se requiere la autorización previa y expresa de la persona autora. En cualquier caso, en la utilización de sus contenidos se deberá indicar de forma clara el nombre y apellidos de la persona autora y el título de la tesis doctoral. No se autoriza su reproducción u otras formas de explotación efectuadas con fines lucrativos ni su comunicación pública desde un sitio ajeno al servicio TDR. Tampoco se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al contenido de la tesis como a sus resúmenes e índices. |
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