A catepsina L, uma cisteína proteinase da família da papaína, é a principal proteinase digestiva do besouro Tenebrio molitor. Estudos anteriores do nosso grupo mostraram que existem três catepsinas L no intestino médio do T. molitor, uma delas é lisossômica (CAL 1) e as outras duas são digestivas (CAL 2 e CAL 3). As estruturas 3D das enzimas digestivas foram recentemente elucidadas. Com o objetivo de estudar em detalhes as propriedades das enzimas digestivas, CAL 3 foi expressa como um zimógeno em E. coli, purificada por cromatografia de afinidade e autoativada em meio ácido. Foram realizados ensaios de atividade com 63 peptídeos FRET derivados da sequência Abz-KLRSSKQ-EDDnp em um espectrofluorímetro termostatizado a 30 ºC, monitorando-se continuamente a variação de fluorescência em 320 nm (λex) e 420 nm (λem). Os parâmetros kcat e KM obtidos foram utilizados na determinação da hidrofobicidade dos subsítios (H) e da função de cada subsítio através da razão das energias livres de ativação do complexo enzima-substrato (ΔG‡T) e de ligação da enzima com o substrato (ΔGs). Os resultados mostram que o subsítio S2 está envolvido prioritariamente em catálise e é bastante seletivo para substratos com resíduos hidrofóbicos em P2. Esse subsítio é o mais hidrofóbico dentre os analisados, encontrando-se num bolsão localizado no interior da enzima. O subsítio S\'2, por outro lado, é o que apresentou a menor especificidade dentre os analisados. Este subsítio está envolvido prioritariamente na ligação com o substrato e se localiza na superfície da enzima, o que pode facilitar a acomodação de diferentes cadeias laterais em P\'2 do substrato, não oferecendo muitas restrições espaciais. O subsítio S1, hidrofílico, não é muito seletivo, o que pode ser consequência de sua localização na superfície da enzima. Esse subsítio está prioritariamente envolvido na ligação com o substrato. O subsítio S\'1, assim como S1, está localizado na superfície da enzima, é hidrofílico e não muito seletivo. No entanto, esse subsítio tem papel na catálise além de atuar na ligação do substrato. Numa análise inicial da estrutura 3D deste subsítio, sua função catalítica foi atribuída à presença de parte da cavidade oxiânica. Uma enzima com mutação no resíduo W187, pertencente à cavidade oxiânica e a S\'1, foi produzida e purificada, no entanto essa enzima não apresentou atividade. Uma análise mais aprofundada mostrou que a falta de atividade pode ser atribuída ao fato do resíduo de aminoácido mutado fazer parte de um cluster aromático essencial à estabilização da tríade catalítica. Os dados obtidos na caracterização de S\'1 e S\'2 permitem inferir que a acilação é o passo limitante da reação da CAL 3. Além disso, os resultados deste trabalho mostram que o conceito de hidrofobicidade de subsítios proposto anteriormente pelo grupo parece ser aplicável a subsítios que apresentem especificidades mais restritas. / Cathepsin L, a cysteine proteinase of the papain family, is the major digestive proteinase in the beetle Tenebrio molitor. Previous studies of our group showed that there are three cathepsins L in T. molitor midgut, one is lysosomal (CAL1) and two are digestive (CAL2 and CAL3). The 3D structures of the digestive enzymes were recently elucidated. With the aim to study in details the digestive enzymes specificities, CAL3 was expressed in E. coli as a zymogen, purified by affinity chromatography and autoactivated in acid conditions. Activity assays were performed in a thermostated spectrofluorometer at 30 ºC with 63 FRET peptides derived from the lead sequence Abz-KLRSSKQ-EDDnp, continuously monitoring the fluorescence changes at 320 nm (λex) and 420 nm (λem). The parameters kcat and KM were used in the determination of subsite hydrophobicity (H) and subsite role based on the ratio of complex enzyme-substrate activation energy (ΔG‡T) and free energy of substrate binding (ΔGs). The data obtained suggest that the S2 is mainly involved in catalysis and is very selective to substrates with hydrophobic residues in P2. This subsite is the most hydrophobic among the analyzed and is located in a pocket in the enzyme interior. S\'2, on the other hand, is the less selective subsite and is mainly involved in substrate binding and is located on the enzyme surface, what can ease the accommodation of different side chains located in P\'2 by not imposing many spatial restrictions. S1, is hydrophilic and not very selective, what may be a consequence of its location on the enzyme surface. This subsite is mainly involved in substrate binding. S\'1, just like S1, is located on the enzyme surface, is hydrophilic and not very selective. However this subsite has a role in catalysis besides the role in substrate binding. In an initial 3D structure analysis its catalytic function was attributed to the presence of a part of the oxyanion hole. An enzyme with mutation in the residue W187, which apparently belonged both to the oxyanion hole and S\'1, was produced and purified, but this enzyme was inactive. A better analysis showed that the lack of activity can be attributed to the fact that the mutated residue belongs to an aromatic cluster that is essential to the catalytic triad stabilization. The data obtained in S\'1 and S\'2 characterization suggest that acylation is the limiting step in CAL 3 reaction. The results presented in this work support the concept of subsite hydrophobicity previously proposed by our group, which seems to be true to subsites with more restrict specificities
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20012015-143853 |
| Date | 27 May 2014 |
| Creators | Damasceno, Ticiane Fraga |
| Contributors | Terra, Walter Ribeiro |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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