Styrol-Monooxygenasen (SMOs) spielen im bakteriellen Abbau von Styrol eine wichtige Rolle. Sie epoxidieren den Kohlenwasserstoff zu (S)-Styroloxid und waren bis vor kurzem vor allem aus Gram-negativen Vertretern wie Pseudomonaden bekannt. Das Grampositive nocardioforme Bodenbakterium Rhodococcus opacus 1CP kann Styrol als Energie- und Kohlenstoffquelle nutzen und verfügt über zwei Typen von SMOs. Neben StyA2B, einer fusionierten FAD:NADH-Oxidoreduktase (StyB) und Monooxygenase (StyA2) findet sich eine weitere Monooxygenase StyA1, deren Gen direkt stromaufwärts zu styA2B lokalisiert ist. Zusätzlich zum natürlichen Fusionsprotein StyA2B gelang kürzlich die Konstruktion künstlicher Fusionen StyAL1B und StyAL2B aus Pseudomonas fluorescens ST.
Um sowohl StyA1/StyA2B als auch die künstlichen Fusionen StyAL1B und StyAL2B für eine biotechnologische Anwendung nutzen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit angestrebt, ihre spezifische Oxygenierungsaktivität (StyA1/StyA2B: 0,24 U/mg) mit Hilfe der error prone PCR zu erhöhen. Um Veränderungen der katalytischen Aktivität in
einer großen Zahl von Mutanten schnell zu erkennen, ist ein einfacher Screeningtest erforderlich. Die Fähigkeit von SMOs zur Oxidation von Indol zu blauem Indigo bietet diese Möglichkeit. Allerdings ist hierfür die Expression löslicher Proteine eine wesentliche Voraussetzung. Versuche zur Veränderung der Gene styA2B und styA1A2B mit Hilfe eines kommerziellen error prone PCR Kits lieferten ca. 300 bis 1.200 mutmaßlich veränderte Klone, welche jedoch keinerlei Aktivität für den Indolumsatz zeigten. Als Ursache wurde eine Expression der Proteine in Form inaktiver Inclusion Bodies vermutet.
Die Fusionsproteine StyAL1B und StyAL2B bilden lösliches Protein, welche Indol zum blauen Farbstoff Indigo umsetzen. Verschiedene Kultivierungsbedingungen wurden auf den Umsatz von Indol untersucht. Dabei wurde erkannt, dass die Klone sich nicht identisch bezüglich ihrer Proteinlöslichkeit verhalten. Mit Hilfe dieser Ergebnisse wurde ein Test für das Aktivitätsscreening von Styrol-Monooxygenasen auf Platte entwickelt. Die Erhöhung der NaCl-Konzentration im Medium steigerte die Indoloxidation, welche sich jedoch durch zusätzliche physiologisch Faktoren schwer beeinflussen lassen.
Auch für die Fusionsproteine erfolgte die Durchführung einer error prone PCR. Der Schritt der error prone PCR stellte kein Problem dar, jedoch die Einbindung des veränderten Genfragmentes in den Vektor, beziehungsweise dessen Transformation in E. coli. Alternative Strategien, wie die Nutzung alternativer DNA Polymerasen und eines konventionellen Konzepts, bei dem veränderte Gene in geschnittene Expressionsvektoren ligiert werden, führte zu keinen detektierbaren Klonen.
Die Kultivierung von identischen Klonen auf Festmedium wirkte sich aufgrund nicht näher identifizierter Einflüsse auf das Verhalten bezüglich der Indoloxidation sehr unterschiedlich aus. Um diese Einflüsse zu minimieren, erfolgte die Untersuchung des Systems in einer Flüssigkultur. Im Blickpunkt stand hierbei die Indigoproduktion von E. coli BL21 (pET_StyAL2B) die in Abhängigkeit der optischen Dichte der Kultur untersucht wurde.:Eidesstattliche Erklärung II
Danksagung III
Zusammenfassung IV
Abstract VI
Abbildungsverzeichnis XI
Tabellenverzeichnis XIII
Abkürzungsverzeichnis XIV
1 Einleitung 1
1.1 Styrol - ein Produkt der Industrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.1 Abbauwege von Styrol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.2 Struktur, Vorkommen und Eigenschaften klassischer Zweikomponenten
Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.3 Das neuartige Styrol-Monooxygenase-System StyA1/StyA2B aus
Rhodococcus opacus 1CP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2.4 Künstlich verlinkte SMO aus Pseudomonas uorescens ST . . . . . 7
1.2.5 Biotechnologischer Einsatz von Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . 8
1.3 Strategien des Protein-Engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.1 Arbeitsmethoden zur Veränderung von DNA . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.2 Error prone PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4 Arbeitsziele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2 Material und Methoden 13
2.1 Bakterienstämme und Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.2 Kultivierungsmedien und -bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.2.1 Kultivierungsmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.2.2 Kultivierungstemperaturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3.1 Primer und Primerdesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3.2 Standard-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.4 Fehlerbehaftete Polymerase-Kettenreaktion (epPCR) . . . . . . . . . . . . 17
2.4.1 Synthese der mutagenen Megaprimer . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.4.2 EZClone Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.4.3 Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.4.4 Modi zierung des Protokolls des EZClone Reaktion Schrittes . . . . 20
2.5 Aufreinigung von PCR-Produkten aus der Lösung . . . . . . . . . . . . . . 20
2.6 TAE-Agarose-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.8 Bestimmung der DNA-Konzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.9 Restriktionsverdau von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.10 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.11 Herstellung von kompetenten Zellen (E.coli DH5ff, E. coli BL21) . . . . . 23
2.11.1 Chemisch kompetente Zellen nach der CaCl2-Methode (42) . . . . . 23
2.11.2 TOP10 chemischkompetente Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.12 Transformation nach der Hitzeschock-Methode (19) . . . . . . . . . . . . . 24
2.13 Plasmidpräparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.14 Bestimmung der Indigobildung durch Klone mit mutmaÿlicher SMO-Aktivität 24
2.14.1 Abschätzung der Indigobildung durch Augenschein . . . . . . . . . 25
2.14.2 Quanti zierung der Indigobildung mittels UV/Vis-Spektrophotometrie 25
2.14.3 Quanti zierung der Indigobildung aus Flüssigkulturen . . . . . . . . 26
3 Ergebnisse 27
3.1 Versuche der error prone PCR von StyA2B aus Rhodococcus opacus 1CP . 27
3.1.1 Isolation von Templat-DNA und Durchführung der error prone PCR 28
3.1.2 Screening von Transformanden auf Fähigkeit zur Indol-Oxidation . 29
3.1.3 Herstellung und Aktivitätsscreening von E. coli DH5ff pET_StyA2B 30
3.2 Versuche der error prone PCR von styA1/styA2B aus Rhodococcus opacus
1CP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.2.1 Durchführung der error prone PCR und Aktivitätsscreening von
StyA1/StyA2B in pBluescript KS(+) . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.2.2 Durchführung des Aktivitätsscreening von StyA1/StyA2B in pET16bP 32
3.3 Fusionsproteine StyAL1B und StyAL2B aus Pseudomonas uorescens ST . 33
3.3.1 Optimierung der Zusammensetzung des LB-Mediums für das Aktivitätsscreenings
von pET_StyAL2B in E. coli BL21 nach einer Transformation
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.3.2 Ein uss der Belüftung auf die Neigung von E. coli BL21 (pET_StyAL2B)
Kolonien zur Oxidation von Indol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.3.3 Bestimmung der Indigobildung mittels UV/Vis-Spektroskopie . . . 40
3.3.4 Zeitliche Entwicklung der Indigokonzentration einer Flüssigkultur
von E. coli BL21 (pET_StyAL2B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.3.5 Error prone PCR von pET_StyAL2B mit Gene Morph II EZ Clone
Kit. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.3.6 Error prone PCR nach der klassischen Methode mit pET_StyAL1B
und pET_StyAL2B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4 Diskussion der Ergebnisse 49
4.1 Die error prone PCR als attraktive Methodik zur Optimierung von Styrol-
Monooxygenasen hinsichtlich katalytischer Eigenschaften . . . . . . . . . . 49
4.2 Der Aktivitätsnachweis als mutmaÿlich limitierender Schritt in der Modi-
zierung von StyA2B und StyA1/StyA2B mit Hilfe der error prone PCR . 51
4.3 Die künstlich fusionierten Styrol-Monooxygenasen StyAL2B und StyAL1B
erlauben ein Aktivitätsscreening auf Platte . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.4 Die Entwicklung einer Methodik zur Quanti zierung der spezi schen Indigobildung
eines Expressionsklons der Styrol-Monooxygenase StyAL2B . . . 58
4.5 Fehleranalyse zur error prone PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.5.1 Fehler in der klassischen error prone PCR für pET_StyAL1B und
pET_StyAL2B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Literaturverzeichnis 65 / Styrene monooxygenases (SMOs) play an important role in the bacterial degradation of styrene. They epoxidize the hydrocarbon highly enantioselective to (S)-styrene oxide. Most of the styrene monooxygenases known so far were identified in Gram-negative microorganisms like pseudomonads. Rhodococcus opacus 1CP, a Gram-positive nocardioform actinobacterium, which uses styrene as energy and carbon source was recently found to possess a novel type of SMO, StyA2B. This protein represents a natural fusion between an FAD:NADH oxidoreductase (StyB) and a single monooxygenase subunit (StyA2) and might act in combination with another single oxygenase StyA1 in strain 1CP. Two artificial analogs to StyA2B, designated StyAL1B and StyAL2B, were recently prepared by a fusion of styA and styB of Pseudomonas fluorescens ST and both showed oxygenating
activity.
For StyA1/StyA2B as well as the artificial fusion proteins StyAL1B and StyAL2B, it was tried to enhance the specific oxygenation activity in order to support their biotechnological applicability. The method of error prone PCR was used for that purpose. In order to identify favorable modifications with increased catalytic activity from a high number of mutants, an easy and simple screening test is necessary. Therefore, it is reasonable to use the ability of SMOs to oxidize indole to the blue dye indigo. However, the expression of SMOs as soluble proteins is an important requirement for any activity screening. Attempts to modify the genes styA2B and styA1/styA2B by means of a commercial error prone PCR kit yielded 300 to 1,200 potential mutants. Unfortunately, none of the obtained colonies showed any indole-oxidizing activity and the formation of insoluble inclusion bodies was assumed to be a likely explanation.
In contrast to StyA2B and StyA1, recombinant expression of the artificial fused SMOs StyAL1B und StyAL2B should yield detectable amounts of active proteins. In fact, cultivation of clones expressing both types of proteins showed a blue coloration. Since the coloration of clones from one single solid medium evolved in a non-uniform manner, cultivation
conditions were varied in order to identify factors which promote a more uniform tendency for indole oxidation. Although a high NaCl concentration in the medium was shown to favor indole oxidation, the latter one seems to be influenced by additional physiological factors, hardly to control.
For the artificially fused proteins an error prone PCR was carried out, too. Although the initial step of mutagenic PCR was found to be successful, completing the vector system by a second ll-up PCR reaction failed. Alternative strategies like the usage of alternative DNA polymerases as well as a conventional cloning approach of various genes into a digested expression vector did not lead to detectable clones. The cultivation of identical clones on petri dishes provided no uniform tendency for indole oxidation and thus did not allow the reliable comparison of mutants in respect of their specific SMO activities. Cultivation of mutants in liquid medium should lead to more reproducible conditions and for that purpose a method was successfully established to quantify indigo formation and cell density.:Eidesstattliche Erklärung II
Danksagung III
Zusammenfassung IV
Abstract VI
Abbildungsverzeichnis XI
Tabellenverzeichnis XIII
Abkürzungsverzeichnis XIV
1 Einleitung 1
1.1 Styrol - ein Produkt der Industrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.1 Abbauwege von Styrol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.2 Struktur, Vorkommen und Eigenschaften klassischer Zweikomponenten
Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.3 Das neuartige Styrol-Monooxygenase-System StyA1/StyA2B aus
Rhodococcus opacus 1CP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2.4 Künstlich verlinkte SMO aus Pseudomonas uorescens ST . . . . . 7
1.2.5 Biotechnologischer Einsatz von Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . 8
1.3 Strategien des Protein-Engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.1 Arbeitsmethoden zur Veränderung von DNA . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.2 Error prone PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4 Arbeitsziele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2 Material und Methoden 13
2.1 Bakterienstämme und Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.2 Kultivierungsmedien und -bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.2.1 Kultivierungsmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.2.2 Kultivierungstemperaturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3.1 Primer und Primerdesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3.2 Standard-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.4 Fehlerbehaftete Polymerase-Kettenreaktion (epPCR) . . . . . . . . . . . . 17
2.4.1 Synthese der mutagenen Megaprimer . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.4.2 EZClone Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.4.3 Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.4.4 Modi zierung des Protokolls des EZClone Reaktion Schrittes . . . . 20
2.5 Aufreinigung von PCR-Produkten aus der Lösung . . . . . . . . . . . . . . 20
2.6 TAE-Agarose-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.8 Bestimmung der DNA-Konzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.9 Restriktionsverdau von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.10 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.11 Herstellung von kompetenten Zellen (E.coli DH5ff, E. coli BL21) . . . . . 23
2.11.1 Chemisch kompetente Zellen nach der CaCl2-Methode (42) . . . . . 23
2.11.2 TOP10 chemischkompetente Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.12 Transformation nach der Hitzeschock-Methode (19) . . . . . . . . . . . . . 24
2.13 Plasmidpräparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.14 Bestimmung der Indigobildung durch Klone mit mutmaÿlicher SMO-Aktivität 24
2.14.1 Abschätzung der Indigobildung durch Augenschein . . . . . . . . . 25
2.14.2 Quanti zierung der Indigobildung mittels UV/Vis-Spektrophotometrie 25
2.14.3 Quanti zierung der Indigobildung aus Flüssigkulturen . . . . . . . . 26
3 Ergebnisse 27
3.1 Versuche der error prone PCR von StyA2B aus Rhodococcus opacus 1CP . 27
3.1.1 Isolation von Templat-DNA und Durchführung der error prone PCR 28
3.1.2 Screening von Transformanden auf Fähigkeit zur Indol-Oxidation . 29
3.1.3 Herstellung und Aktivitätsscreening von E. coli DH5ff pET_StyA2B 30
3.2 Versuche der error prone PCR von styA1/styA2B aus Rhodococcus opacus
1CP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.2.1 Durchführung der error prone PCR und Aktivitätsscreening von
StyA1/StyA2B in pBluescript KS(+) . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.2.2 Durchführung des Aktivitätsscreening von StyA1/StyA2B in pET16bP 32
3.3 Fusionsproteine StyAL1B und StyAL2B aus Pseudomonas uorescens ST . 33
3.3.1 Optimierung der Zusammensetzung des LB-Mediums für das Aktivitätsscreenings
von pET_StyAL2B in E. coli BL21 nach einer Transformation
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.3.2 Ein uss der Belüftung auf die Neigung von E. coli BL21 (pET_StyAL2B)
Kolonien zur Oxidation von Indol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.3.3 Bestimmung der Indigobildung mittels UV/Vis-Spektroskopie . . . 40
3.3.4 Zeitliche Entwicklung der Indigokonzentration einer Flüssigkultur
von E. coli BL21 (pET_StyAL2B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.3.5 Error prone PCR von pET_StyAL2B mit Gene Morph II EZ Clone
Kit. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.3.6 Error prone PCR nach der klassischen Methode mit pET_StyAL1B
und pET_StyAL2B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4 Diskussion der Ergebnisse 49
4.1 Die error prone PCR als attraktive Methodik zur Optimierung von Styrol-
Monooxygenasen hinsichtlich katalytischer Eigenschaften . . . . . . . . . . 49
4.2 Der Aktivitätsnachweis als mutmaÿlich limitierender Schritt in der Modi-
zierung von StyA2B und StyA1/StyA2B mit Hilfe der error prone PCR . 51
4.3 Die künstlich fusionierten Styrol-Monooxygenasen StyAL2B und StyAL1B
erlauben ein Aktivitätsscreening auf Platte . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.4 Die Entwicklung einer Methodik zur Quanti zierung der spezi schen Indigobildung
eines Expressionsklons der Styrol-Monooxygenase StyAL2B . . . 58
4.5 Fehleranalyse zur error prone PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.5.1 Fehler in der klassischen error prone PCR für pET_StyAL1B und
pET_StyAL2B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Literaturverzeichnis 65
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:22784 |
| Date | 01 July 2011 |
| Creators | Born, Ariane |
| Contributors | Schlömann, Michael, Kaschabek, Stefan, Tischler, Dirk, Heilmeier, Hermann, TU Bergakademie Freiberg |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:masterThesis, info:eu-repo/semantics/masterThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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