L’érythropoïèse est le processus aboutissant à la production des hématies à partir d’une cellule souche hématopoïétique. La différenciation érythroïde implique des changements morphologiques en partie liés à la perte d’expression membranaire du récepteur à activité tyrosine kinase de classe III, c-Kit. En réponse à son ligand, le SCF, c-Kit est activé puis internalisé et dégradé par la voie du protéasome, via l’ubiquitine E3-ligase c-Cbl, ou par la voie lysosomale suite à une endocytose. Dans la première partie de ce travail, nous avons pu mettre en évidence qu’en absence de SCF et en réponse à un inhibiteur de tyrosine kinase, l’imatinib, les érythroblastes cultivés ex vivo perdent l’expression membranaire de c-Kit et accélèrent leur entrée en différenciation terminale. Au vu de ces observations, nous avons cherché à comprendre les mécanismes impliqués. Sur un modèle de cellules érytholeucémiques dépendantes de l’érythropoïétine, mais exprimant de manière endogène c-Kit, nous avons montré que l’imatinib induit une internalisation du récepteur ainsi que sa dégradation par la voie lysosomale et de manière indépendant de c-Cbl. De plus, nous avons montré que cet effet est réversible et que l’imatinib ne bloque pas la réexpression de c-Kit après son internalisation en réponse au SCF. Des marquages métaboliques ont permis de montrer que l’imatinib ne modifie ni la synthèse ni la maturation de c-Kit et que le profil phospho-tyrosine des cellules traitées à l’imatinib est globalement inchangé. Enfin, nous avons montré que la fixation de l’imatinib à la poche catalytique de c-Kit est indispensable à son internalisation, et par conséquent à sa dégradation. Il apparait donc que l’imatinib lève l’auto-inhibition de c-Kit, qui semble nécessaire pour son maintien à la membrane. Dans la seconde partie de ce travail, nous nous sommes intéressés aux changements morphologiques subis par les nucléoles, lieu de la biogenèse des ribosomes, au cours de différenciation des érythroblastes. L’étude de la taille et du potentiel prolifératif des cellules, ainsi que l’analyse morphologique des nucléoles, nous a permis de confirmer que la réduction de taille des cellules est contemporaine d’un ralentissement de leur prolifération ainsi que de la réduction du volume et de la surface du composé granulaire (CG), « matrice » du nucléole. En microscopie électronique, nous montrons la persistance des CG en fin de maturation. Enfin, nous avons également étudié l’évolution des nucléoles dans un contexte pathologique de syndromes myélodysplasiques de faible risque, qui se caractérisent par une hématopoïèse inefficace. Nous observons que les cellules pathologiques immatures ont des CG plus volumineux que les cellules normales immatures, et qu’au cours de la différenciation, la morphologie des nucléoles est identique entre les cellules normales et pathologiques. En conclusion, ce travail a permis de décrire 1) le mécanisme d’internalisation d’un récepteur à activité tyrosine kinase de classe III, c-Kit par l’imatinib et 2) la morphologie du nucléole au cours de la différenciation érythroïde normale et pathologique des syndromes myélodysplasiques de faible risque. / Erythropoiesis is the process leading to the production of red blood cells from hematopoietic stem cell. The erythroid differentiation involves morphological cell changes, in part related to the loss of membrane expression of the type III receptor tyrosine kinase, c-Kit. In response to its ligand SCF, c-Kit is activated, then internalized and degraded by the proteasome pathway via the E3 ubiquitin ligase c-Cbl, or by the lysosomal pathway, after endocytosis. In the first part of this work, we demonstrated that in the absence of SCF and in response to tyrosine kinase inhibitor, imatinib, erythroblasts cultured ex vivo, lose membrane expression of c-Kit and accelerate their terminal differentiation. In view of these observations, we sought to understand the mechanisms involved. On an erythropoietin dependent cell line expressing c-Kit at the membrane, we showed that imatinib induces receptor internalization and degradation by the lysosomal pathway, independently of c -Cbl. Furthermore, we showed that this effect is reversible and that imatinib does not block the c-Kit re-expression after its internalization, in response to SCF. Metabolic labelling showed that imatinib does not alter synthesis or maturation of c -Kit and that the phospho-tyrosine profile of cells treated with imatinib is generally unchanged. Finally, we showed that the binding of imatinib to the catalytic pocket of c-Kit is essential for its internalization, and therefore its degradation. So, it appears that imatinib removes c-Kit self-inhibition, which seems necessary to its retention at the membrane. In the second part of this work, we studied the morphological changes of nucleoli, the site of ribosome biogenesis, during erythroid differentiation. We showed that the reduction of cell size takes place at the same time than reduction of cell proliferation and reduction of surface and volume of the Granular Compound (GC), the “matrix” of the nucleolus. Moreover, we showed by electronic microscopy, the persistence of GC at the end of maturation. Finally, we also studied the evolution of nucleoli in a pathological context of low risk myelodysplastic syndromes, which are characterized by ineffective hematopoiesis. We observed that immature pathological cells have larger GC than immature normal cells, but that during differentiation, the morphology of nucleoli is identical between normal and pathological cells. In conclusion, this work has allowed us to describe 1) the mechanisms of internalization of a class III receptor tyrosine kinase, c-Kit by imatinib and 2) the morphology of the nucleolus during normal and pathological low risk myelodysplastic syndromes of erythroid differentiation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013PA05S026 |
| Date | 12 September 2013 |
| Creators | Allard, Diane d' |
| Contributors | Paris 5, Fontenay, Michaëla |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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