Les cèl·lules reaccionen front els estressos ambientals a través de respostes múltiples que ocorren anivell transcripcional i posttranscripcional, per tal d'adaptar-se a les noves condicions i contrarestar elspossibles danys causats per l'estrès. En aquest treball s'analitzen les respostes a estrès tèrmic i oxidatiu deSaccharomyces cerevisiae mitjançant la determinació en paral·lel dels nivells d'mRNA (RA) i de les taxesde transcripció (TR) mitjançant la tècnica de Genomic Run-On (GRO) per a cada gen individual a escalagenòmica. A més, s'utilitza un algoritme matemàtic adaptat a situacions dinàmiques, com és la resposta aestrès, per a calcular les taxes de degradació teòrica dels mRNAs (TD) a partir de les dades experimentalsde TR i RA. Els gens del llevat han estat classificats en diferents grups per homologies de perfils de lescinètiques de TR i RA, resultant distribuïts en 16 i 25 grups en resposta a xoc per calor i a estrès oxidatiu,respectivament. A més, es calcula la mitjana de TD per a cada grup. Aquestes dades prediuen modulacionscausades per la contribució de la TD en els patrons d'expressió de la majoria dels trànscrits. Els resultatsobtinguts mostren dues tendències oposades: una desestabilització general dels mRNA en la resposta aestrès oxidatiu i una estabilització global durant la resposta a l'estrès tèrmic. Malgrat això, en ambdósestressos, un 25% dels gens induïts transcripcionalment no augmenten els seus nivells d'mRNA. Aquestamanca de paral·lelisme prediu canvis importants en l'estabilitat de l'mRNA. Una resposta comuna és larepressió i la forta desestabilització predita en els mRNAs codificants per proteïnes ribosomals i enzimsprocessadors d'rRNA. D'altra banda, la majoria dels mRNAs del proteosoma s'indueixen en els dosestressos i, tot i que aquests s'estabilitzen arran de l'estrès per calor, no ho fan en resposta a l'oxidatiu, fetque suggereix que els canvis en la TD dels mRNAs en resposta a un estrès provoquen diferentsmodulacions específiques sobre l'RA d'aquest grup de gens. Hem confirmat les prediccions matemàtiquesper a alguns gens de diversos grups determinant experimentalment les TDs dels mRNAs emprant elpromotor regulable tetO. Aquest estudi indica que les respostes a estrès en cèl·lules de llevat estancondicionades no només per la transcripció dels gens, sinó també per la dinàmica de la TD dels mRNAs.Les nostres anàlisis GRO permeten observar que, arran d'un estrès oxidatiu, els gens del sistemad'alta afinitat d'adquisició de ferro controlat pel transactivador Aft1 s'indueixen transcripcionalment. Deforma paral·lela, es demostra que Aft1 s'internalitza transitòriament al nucli. En aquestes condicions, elsnivells d'mRNA dels gens de la via no reductiva augmenten, mentre que els trànscrits de la via reductivamediada pel complex Ftr1/Fet3 es mantenen baixos, a causa de la desestabilització del seu mRNA. Enconseqüència, els seus nivells de proteïna també són baixos. La degradació d'aquests mRNAs ocorre per lavia general 5'-3' i és independent de la proteïna d'unió a RNA Cth2. En concordança, les cèl·lules de llevatsón hipersensibles als peròxids quan l'única via funcional d'assimilació de ferro és la via reductiva. Percontra, el peròxid no afecta el creixement quan l'adquisició de ferro es produeix exclusivament a través dela via no reductiva. Això reforça la idea que, en estrès oxidatiu, les cèl·lules d'S. cerevisiae redirigeixenl'assimilació de ferro a través de la via no reductiva per minimitzar el dany oxidatiu dels ions ferrosos. / Las células reaccionan frente estreses ambientales a través de respuestas múltiples que ocurren anivel transcripcional y post-transcripcional para adaptarse a las nuevas condiciones y contrarrestar losposibles daños causados por el estrés. En este trabajo se analizan las respuestas a estrés térmico y oxidativode Saccharomyces cerevisiae mediante la determinación en paralelo de los niveles de mRNA (RA) y latasas de transcripción (TR) usando la técnica de Genomic Run-On (GRO) para cada gen individual a escalagenómica. Además, se utiliza un algoritmo matemático adaptado a situaciones dinámicas, como es larespuesta a estrés, para calcular las tasas de degradación teórica de los mRNAs (TD) a partir de los datosexperimentales de TR y RA. Los genes de la levadura han sido clasificados en diferentes grupos según lashomologías de los perfiles de las cinéticas de TR y RA. De este modo, los genes se distribuyen en 16 y 25grupos en respuesta a estrés térmico y oxidativo, respectivamente. Además, se calcula la media de TD paracada grupo. Estos datos predicen modulaciones causadas por la contribución de la TD, en los patrones deexpresión de la mayoría de los tránscritos. Los resultados obtenidos muestran dos tendencias opuestas: unadesestabilización general del mRNA en la respuesta al estrés oxidativo y una estabilización global en larespuesta al choque térmico. Sin embargo, en ambos estreses, alrededor del 25% de los genes inducidostranscripcionalmente no aumentan sus niveles de mRNA. Estas diferencias predicen cambios importantesen la estabilidad del mRNA, así como en la respuesta transcripcional al estrés. Una respuesta común es larepresión y la desestabilización predicha en los mRNAs codificantes para proteínas ribosomales y enzimasprocesadoras de rRNA. Contrariamente, la mayoría de los mRNAs del proteasoma se inducen en los dosestreses y, aunque estos se estabilizan después del estrés por calor, no lo hacen en respuesta al estrésoxidativo, sugiriendo que cambios en la TD de los mRNAs en respuesta a estrés provocan modulacionesespecíficas sobre el RA. Hemos confirmado las predicciones matemáticas para algunos genes de diversosgrupos determinando experimentalmente las TDs de los mRNAs utilizando el promotor regulable tetO. Esteestudio indica que las respuestas a estrés en células de levadura están condicionadas no sólo por latranscripción de los genes, sino también por la dinámica de la TD de los mRNAs.Nuestros análisis GRO permiten observar que en respuesta a estrés oxidativo los genes del sistemade alta afinidad de adquisición de hierro controlado por el transactivador Aft1 se inducentranscripcionalmente. De forma paralela, se demuestra que Aft1 se internaliza transitoriamente en el núcleo.En estas condiciones, los niveles de mRNA de los genes de la vía no reductiva aumentan. Sin embargo, lostranscritos de la vía reductiva mediada por el complejo Ftr1/Fet3 se mantienen bajos, debido a ladesestabilización de su mRNA. En consecuencia, sus niveles de proteína también son bajos. La degradaciónde estos mRNAs ocurre por la vía general 5'-3' y es independiente de la proteína de unión a RNA Cth2. Enconcordancia, las células de levadura son hipersensibles a los peróxidos cuando la única vía funcional deasimilación de hierro es la vía reductiva. Por el contrario, el peróxido no afecta el crecimiento cuando laadquisición de hierro se produce exclusivamente a través de la vía no reductiva. Esto refuerza la idea que, en respuesta a estrés oxidativo, las células de S. cerevisiae redirigen la asimilación de hierro a través de lavía no reductiva para minimizar el daño oxidativo provocado por los iones ferrosos. / Cells react against environmental stresses through multiple responses occurring at transcriptionaland posttranscriptional levels, in order to adapt themselves to the new conditions and counteract thepossible damage caused by stress. In this work the heat and the oxidative stress responses have beenanalyzed in Saccharomyces cerevisiae by parallel determination of mRNA levels (RA) and transcriptionrates (TR) using the Genomic Run-On (GRO) methodology for each individual gene at a genomic scale.Moreover, a mathematical algorithm has been adapted for dynamic situations, such as the response to stress,to calculate theoretical mRNA decay rates (TD) from the experimental TR and RA data. Yeast genes havebeen grouped into different clusters, according to homologies of theirs RA and TR kinetics. In that way,genes are distributed in 16 and 25 clusters upon heat and oxidative stress, respectively. Moreover, the TDaverage has been calculated for each cluster. These data predict modulations in the RA profiles caused bythe TD contribution for most of the transcripts. Two opposite tendencies are observed in response to suchstresses: a global trend on mRNA destabilization is shown upon oxidative stress response whereas a generalmRNA stabilization occurs during thermal stress response. However, in both stresses, around the 25% ofthe transcriptionally induced genes do not increase their mRNA levels. This lack of parallelism predictsimportant changes in mRNA stability as well as in the transcriptional stress response. As a commonresponse, genes for ribosomal proteins and rRNA processing enzymes are abundant among those whosemRNAs are predicted to destabilize. Most of proteasomal genes are upregulated in both stresses. However,these become stabilized among the heat shock, although not in response to oxidative stress, suggesting thatchanges on the mRNA decay rates in response to one specific stress provoke different responses on themRNA amount. We have confirmed the mathematical predictions for several genes from different clustersby experimentally determining mRNA decay rates using the regulable tetO promoter. This study indicatesthat stress responses in yeast cells are not only conditioned by gene transcription but also by the mRNAdecay dynamics.Our GRO analyses allow the observation that, upon oxidative stress, genes of the high-affinitysystem iron acquisition controlled by the Aft1 transactivator are highly transcribed. In parallel, wedemonstrate that Aft1 is transitorily internalized into the nucleus. In these conditions, the mRNA levels ofthe non-reductive pathway genes become increased. However, transcripts of the Ftr1/Fet3-mediatedreductive pathway remain low due to destabilization of the mRNAs. Consequently, the respective proteinlevels also remain low. Such mRNA destabilization is mediated by the general 5'-3'-mRNA decay pathwayand is independent of the RNA-binding protein Cth2. According with that, yeast cells are hypersensitive toperoxides in growth conditions where only the high-affinity reductive pathway is functional for ironassimilation. On the contrary, peroxide does not affect growth when iron uptake occurs exclusively throughthe non-reductive pathway. This reinforces the idea that upon oxidative stress S. cerevisiae cells redirectiron assimilation through the non-reductive pathway to minimize oxidative damage by the ferrous ions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UDL/oai:www.tdx.cat:10803/8110 |
| Date | 06 September 2010 |
| Creators | Castells i Roca, Laia |
| Contributors | Bellí i Martínez, Gemma, Universitat de Lleida. Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques |
| Publisher | Universitat de Lleida |
| Source Sets | Universitat de Lleida |
| Language | Catalan |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0035 seconds