A cana-de-açúcar é uma gramínea C4 de alta biomassa que acumula grandes quantidades de sacarose e é utilizada para produção de etanol, um combustível de baixa emissão de carbono. Restrições bióticas e abióticas afetam significativamente a produtividade das culturas, pois elas podem prejudicar severamente o crescimento e desempenho da planta. Compreender as bases moleculares para essa perda de produtividade ajudará na investigação das estratégias de mitigação. Para estudar estes dois tipos de estresses, plantas jovens de cana-de-açúcar foram submetidas à herbivoria e à privação de água. Uma investigação foi realizada para estudar as mudanças transcricionais em cana-de-açúcar sujeita ao ataque da Diatraea saccharalis, usando macroarranjo para monitorar a seleção de transcritos, contendo sequências de ESTs de serina proteases e inibidores de serina proteases de cana-de-açúcar do banco de dados SUCEST. Análises do macroarranjo revelaram sequências diferencialmente expressas em resposta à herbivoria. PCR em tempo real confirmou que 10 ESTs homólogos à inibidores de protease (4 homólogos aos inibidores do tipo Bowman-Birk de arroz e milho (BBI), 5 homólogos à inibidores de proteinase de milho (MPI) e 1 homólogo ao inibidor de subtilisina) e 3 ESTs homólogos à serina proteases das famílias S1, S10 e S14 foram positivamente regulados pela herbivoria. Embora a função dos inibidores de protease na defesa está bem estabelecida, o envolvimento de proteases de planta na resposta à herbivoria ainda precisa ser elucidado. Neste trabalho nós mostramos que uma protease da família S14 foi induzida em resposta ao ataque da lagarta e ao ferimento mecânico em cana-de-açúcar. Curiosamente, sequências homólogas de arroz e Arabidopsis também responderam aos mesmos tratamentos, sugerindo um papel conservado desta protease S14 na defesa contra herbívoros. Uma importante aplicação destes resultados é a identificação de genes para utilização em estratégias biotecnológicas para melhorar a resistência da cana-de-açúcar a insetos. Outra investigação foi realizada para estudar os parâmetros fisiológicos e perfis transcricionais de genes responsivos ao estresse hídrico em plantas jovens de cana-de-açúcar. Resultados deste trabalho indicaram que a interrupção da irrigação resultou em efeitos fisiológicos mensuráveis e análises de expressão de genes selecionados de resposta ao estresse revelaram expressão diferencial significativa entre os grupos irrigado e não irrigado. Resultados do RNA-Seq revelaram atividade transcricional de 24.142 transcritos de folhas de cana-de-açúcar submetidas à seca. Análises de expressão gênica em resposta à seca revelaram 68 (resposta precoce) e 2.390 (resposta tardia) transcritos diferencialmente expressos no 3º e 7º dia de tratamento, respectivamente. O decréscimo em vários parâmetros fisiológicos foi observado depois de seis dias de privação de água. Reduções na taxa de fotossíntese, condutância estomática e transpiração foliar ocorreram antes que fossem observadas alterações físicas visíveis, mas estas foram precedidas por mudanças significativas na expressão de genes com papel na fotossíntese. RNA-Seq identificou novos transcritos com papéis na defesa precoce e tardia à seca e a validação por PCR em tempo real confirmou os resultados obtidos pelo RNA-Seq. Isto irá incentivar mais pesquisas sobre a eficiência do uso da água em cana-de-açúcar, levando a identificação de variedades com maior tolerância às condições ambientais adversas. / Sugarcane is a high biomass tropical C4 grass crop which accumulates large quantities of sucrose and is used for bioethanol production, a low-carbon emission fuel. Biotic and abiotic constraints significantly impact crop productivity, because they can severely impair plant growth and performance. Understanding the molecular basis for this loss in productivity will aid in identifying strategies for mitigation. To study these two types of stresses, young sugarcane plants were subject to herbivore and water privation. An investigation was undertaken to study the sugarcane transcriptional changes following Diatraea saccharalis damage, using macroarrays to monitor a selection of transcripts, containing sequences of sugarcane ESTs of serine proteases and serine proteinase inhibitors from the SUCEST (Sugarcane EST Project) database. Macroarray analyses revealed differently expressed sequences in response to herbivory. Real-Time PCR confirmed that 10 ESTs homologous to proteinase inhibitors (4 homologous to maize and rice Bowman-Birk inhibitors (BBI), 5 homologous to maize proteinase inhibitors (MPI) and 1 homologue to subtilisin inhibitor) and 3 ESTs homologous to serine proteases of the S1, S10 and S14 family were positively regulated by herbivory. While the protease inhibitor\'s function in defense is well established, the involvement of plant proteases in response to herbivory still remains to be elucidated. In this work we show that a sugarcane encoding S14 family protease member was upregulated in response to both D. saccharalis damage and wound treatment. Interestingly, homologous sequences from rice and Arabidopsis also responded to the same treatments, suggesting a conserved role of this S14 protease in defense against herbivores. One important application of these results is the identification of genes for use in biotechnological strategies to improve sugarcane insect resistance. Another investigation was undertaken to study the physiological parameters and transcriptional profiles of genes responsive to water stress in young sugarcane plants. Results of this work indicated that termination of irrigation resulted in measurable physiological effects in sugarcane plants and analysis of the expression of the chosen stress-response genes revealed significant differential expression between the control and treatment groups. RNA-Seq results revealed transcriptional activity of 24.142 transcripts from sugarcane leaf subjected to water stress. Gene expression analyses in response to water deprivation revealed 68 (early response) and 2,390 (later response) differentially expressed transcripts on day 3 and day 7, respectively. Sustained decreases in various physiological parameters were observed in water-stressed sugarcane plants after six days of water deprivation. Reductions in photosynthesis rate, stomatal conductance and leaf transpiration occurred before visible physical changes were observed, but this was preceded by significant changes in expression of genes with roles in photosynthesis. RNA-seq identified novel transcripts with roles in early and late response to drought stress and Real-Time qPCR validation confirmed the RNA-Seq results. This will inform further research on water use efficiency in sugarcane, leading to identification of varieties with improved tolerance to adverse environmental conditions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-30102013-140630 |
| Date | 08 October 2013 |
| Creators | Mingossi, Fabiana Bombonato |
| Contributors | Silva Filho, Marcio de Castro |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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