Las hidrofobinas son una familia de proteínas fúngicas hidrofóbicas de secreción, de pequeño tamaño molecular, que exhiben capacidad para autoensamblarse y para unirse a una interfase hidrofílica/hidrofóbica formando una película anfipática (Wessels, 1997). Son proteínas que se dan exclusivamente en hongos miceliares, se caracterizan por presentar ocho residuos de cisteína conservados en sus secuencias (Wessels, 1994, 1997) que forman puentes disulfuro intramoleculares (De Vries et al., 1993), y están implicadas en la formación de estructuras aéreas y en la unión de las hifas a estructuras hidrofóbicas formando agregados. Estas proteínas poseen gran importancia en los pasos iniciales de la patogénesis fúngica y también son fuentes potenciales para su uso en aplicaciones biomédicas (Wessels, 1997).En este trabajo se describe por primera vez en el hongo dimórfico, patógeno oportunista, Candida albicans, la caracterización de una especie perteneciente a esta familia de proteínas. Mediante el inmunorrastreo de una genoteca de expresión con un anticuerpo policlonal específico de la forma micelial de C. albicans (mPAb), se ha aislado, clonado y caracterizado un nuevo gen de este hongo, al que se ha denominado CaHPB. Dicho gen contiene un posible marco abierto de lectura que codifica para una proteína de 250 aminoácidos (CaHpbp) con un peso molecular de 25.173 Da. El análisis informático de la secuencia reveló la existencia de una región de unos 115 aminoácidos que contiene ocho restos de cisteína localizados en posiciones altamente conservadas, así como de un péptido señal de secreción y de un posible motivo tipo GPI, características compartidas con otras proteínas de la pared celular de C. albicans parcialmente caracterizadas como son Rbt5p y Csa1p/Wap1p.Los ensayos de inmunofluorescencia con un anticuerpo policlonal monoespecífico generado frente a un dominio inmunogénico de la proteína CaHpbp (PAb anti-CaHpbp) reveló que esta molécula se encontraba presente en la superficie celular de C. albicans, mayoritariamente en la forma micelial del hongo.El análisis mediante inmunotransferencia de diferentes extractos obtenidos tanto de paredes celulares aisladas como de células intactas, utilizando el PAb anti-CaHpbp como sonda, indicó que la proteína CaHpbp es secretada al medio extracelular, encontrándose asociada a la superficie de las células del hongo mediante interacciones de tipo no covalente. El marcaje con cisteína radiactiva permitió cuantificar la eficacia de diferentes agentes para solubilizar la especie CaHpbp, encontrándose que el SDS al 1% a pH 9 y el etanol al 60% eran los tratamientos que tenían mayor capacidad de extracción.La especie CaHpbp mostró capacidad para interaccionar con micelas de aceite en una interfase hidrofílica/hidrofóbica de agua y aceite, formando en la superficie de las mismas una capa detectable mediante inmunofluorescencia con el PAb anti-CaHpbp, que podría representar una membrana anfipática. La molécula CaHpbp presente en el medio de cultivo también exhibió la propiedad de adsorberse a la superficie de microesferas de vidrio. Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que la especie CaHpbp se trata de una hidrofobina de clase II, moléculas de secreción que hasta el momento no se han identificado en C. albicans, aunque sí en otras especies de hongos patógenos. CaHpbp se expresa in vivo, como se deduce de los resultados de la detección inmunohistoquímica en los cuales, se observa la expresión de esta molécula en células de C. albicans presentes en muestras de tejidos obtenidas por necropsia y biopsia de pacientes con candidiasis sistémica y/o superficial. Estas observaciones sugieren que la especie CaHpbp podría tener un papel como factor de virulencia en este hongo. / In this work, we have cloned and characterized a class II hydrophobin-like molecule in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans, which exhibits all the characteristics previously described for this type of secretory proteins in other fungal species. Hydrophobins are a small secreted fungal proteins that self-assemble at hydrophilic/hydrophobic interfaces into amphipathic films thereby changing the nature of surfaces (i.e., hydrophobic surfaces become hydrophilic, while hydrophilic surfaces become hydrophobic) and are among the most surface-active biosurfactants known. This attribute can be used to introduce hydrophobic foci on the surface of hydrophilic supports where hydrophobins are attached by covalent binding in response to the environment. Hydrophobins are characterized by the presence of eight conserved cysteine residues that from four disulphide bridges and by a typical hidropathy pattern. Hydrophobins have been classified into two classes, class I and class II hydrophobins. Apart from eight conserved cysteine residues, the amino acid sequences between and within both classes have diverged considerably, and this is reflected in the biophysical properties of these proteins. For instance, assemblages of class I hydrophobins are highly insoluble and only can be dissolved by treatment with formic acid or trifluoroacetic acid, while those of class II hydrophobins only can be dissolved by SDS or ethanol. The properties of hydrophobins make them interesting candidates for use in a wide range of medical and technical applications. Each application has its own requirements, which may be met by using specific natural variants of hydropnobins or by modifying hydrophobins chemically or genetically. Applications also require high production systems for hydrophobins. In this respect, filamentous fungi that naturally secrete hydrophobins into the medium seem to be the hosts of choice. They have been shown to be important in many morphogenetic processes, including sporulation, fruit body development, and infection structure formation. The characterization for the first time of a molecule of this nature in C. albicans may open new therapeutic and diagnostic approaches for the management of candidiasis, since hydrophobins most likely may be related with virulence (allowing the fungal cells to interact better with host tissues during infection) and these kind of fungal moieties are not synthesized by animal cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UV/oai:www.tdx.cat:10803/10100 |
| Date | 16 December 2003 |
| Creators | Pedrós Marí, Beatriz |
| Contributors | Casanova Monroig, Manuel, Martínez García, José Pedro, Universitat de València. Departament de Microbiologia i Ecologia |
| Publisher | Universitat de València |
| Source Sets | Universitat de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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