Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As toxinas A e B do Clostridium difficile (TcdA e TcdB) sÃo glicosiltransferases homÃlogas que inibem um grupo de pequenas GTPases dentro da cÃlula hospedeira, contudo, vÃrios mecanismos envolvidos na atividade patogÃnica dessas toxinas permanecem desconhecidos. No presente estudo, avaliamos os efeitos das TcdA e TcdB na via de Wnt/Beta-catenina que representa a forÃa motora principal responsÃvel pela proliferaÃÃo das cÃlulas epiteliais nas criptas colÃnicas. Foram utilizadas cÃlulas IEC-6 (cÃlulas epiteliais de criptas de Rattus novergicus) e RKO (cÃlulas de adenocarcinoma de cÃlon humano). Estas cÃlulas foram estimuladas com meio condicionado contendo Wnt3a e incubadas com 10, 50 ou 100 ng/mL de TcdA ou 1, 5 ou 10 ng/mL de TcdB por 24h, resultando em uma inibiÃÃo dose-dependente da via de sinalizaÃÃo canÃnica de Wnt, como demonstrado pelo ensaio de repÃrter de fator de cÃlula T (TCF). Esse resultado foi corroborado pelos dados da imunofluorescÃncia com marcaÃÃo para a localizaÃÃo nuclear de Beta-catenina e por western blotting para Beta-catenina e c-MYC (gene-alvo da via de Wnt). AlÃm disso, os dados do experimento de western blot evidenciaram uma diminuiÃÃo dos nÃveis da proteÃna Beta-catenina, o qual foi prontamente revertido por z-VAD-fmk, um pan-inibidor de caspase. Entretanto, a TcdA ainda foi capaz de inibir a via de Wnt/Beta-catenina mesmo na presenÃa do z-VAD-fmk, cloreto de lÃtio (um inibidor de GSK3Beta) ou plasmÃdeo de Beta-catenina constitutivamente ativo, como determinado pelo ensaio do TCF (TOPFlash/Luciferase). O estudo evidenciou ainda que a prÃ-incubaÃÃo de cÃlulas RKO com TcdA por 12h tambÃm atenuou a ativaÃÃo da via de Wnt mediada por Wnt3a, o que sugere que a inativaÃÃo de RhoGTPases, particularmente Rac1, possui um papel nessa inibiÃÃo. Em conclusÃo, esses achados sugerem que a inibiÃÃo da via canÃnica de Wnt pelas TcdA e TcdB representa um mecanismo importante da sua patogÃnese e explica seus efeitos anti-proliferativos. / Clostridium difficile toxins A and B (TcdA and TcdB) are homologous glycosyltransferases that inhibit a group of small GTPases within host cells, but several mechanisms underlying their pathogenic activity remain unclear. Here, we evaluated the effects of TcdA and TcdB on the Wnt/Beta-catenin pathway, the major driving force behind the proliferation of epithelial cells in colonic crypts. IEC-6 and RKO cells stimulated with Wnt3a-conditioned medium were incubated with 10, 50 and 100 ng/mL of TcdA or TcdB for 24h, resulting in a dose-dependent inhibition of the Wnt signaling, as demonstrated by a T-cell factor (TCF) reporter assay. This was further confirmed by immunofluorescence staining for nuclear localization of Beta-catenin and western blotting for Beta-catenin and c-Myc (encoded by a Wnt target gene). Moreover, our western blot analysis showed a decrease in the Beta-catenin protein levels, which was reversed by z-VAD-fmk, a pan-caspase inhibitor. Nonetheless, TcdA was still able to inhibit the Wnt/Beta-catenin pathway even in the presence of z-VAD-fmk, lithium chloride (a GSK3B inhibitor), or constitutively active Beta-catenin, as determined by a TCF reporter assay. Furthermore, pre-incubation of RKO cells with TcdA for 12h also attenuated Wnt3a-mediated activation of Wnt signaling, suggesting that inactivation of Rho GTPases plays a significant role in that inhibition. Taken together, these findings suggest that attenuation of the Wnt signaling by TcdA and TcdB is important for their anti-proliferative effects.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:9413 |
| Date | 30 May 2014 |
| Creators | Bruno Bezerra Lima |
| Contributors | Gerly Anne de Castro Brito, Aldo Ãngelo Moreira Lima, LÃcia LibanÃz Bessa Campelo Braga, Josà Garcia Ribeiro Abreu Junior, Adriana Abalen Martins Dias |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Farmacologia, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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