In den vergangenen Jahrzehnten kam es durch den Einsatz massiv immunsupprimierender Therapien zu einer steigenden Inzidenz invasiver Mykosen. Die durch eine Infektion mit A. fumigatus ausgelöste invasive Aspergillose stellt eine lebensbedrohliche Erkrankung für Patienten mit hämatologischen Malignomen oder nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation dar. Für die Behandlung solcher Erkrankungen ist eine frühzeitige Diagnosestellung unabdingbar. Da invasive diagnostische Maßnahmen bei den betroffenen Patienten jedoch häufig kontraindiziert sind, werden neue Biomarker und nicht invasive Diagnoseverfahren intensiv beforscht.
Ein kürzlich beschriebener Ansatz zur Primär- und Verlaufsdiagnostik bei Patienten mit invasiven pulmonalen Aspergillosen und Mukormykosen ist die Verwendung des auf aktivierten T-Zellen exprimierten Aktivierungsmarkers CD154 zur durchflusszytometrischen Quantifizierung A. fumigatus-spezifischer T-Helfer-Zellen.
Die Detektion dieser Zellen mit dem in der Literatur beschriebenen Protokoll erfordert die Isolation von PBMCs und duldet vor der Verarbeitung der Proben in einem spezialisierten Labor nur kurze präanalytische Lagerungszeiten. Dies stellt einen limitierenden Faktor für die klinische Verwendbarkeit des beschriebenen Assays dar.
Die vorliegende Dissertationsschrift beschäftige sich damit, den beschriebenen Assay zur Detektion A. fumigatus-spezifischer T-Zellen, hinsichtlich seiner Präanalytik und klinischen Anwendbarkeit eingehender zu evaluieren und zu optimieren.
Zunächst konnte gezeigt werden, dass mittels Verdünnung und Agitation der zur PBMC Isolation verwendeten Blutproben eine Verlängerung des präanalytischen Zeitfensters zwischen Blutentnahme und Aufbereitung auf bis zu 4 h möglich ist, ohne dass dabei die Sensitivität des CD154-basierten T-Zell-Assays beeinträchtigt wird.
Weiterhin konnte die Verwendung eines Vollblut-basierten Protokolls, das auf die zeitaufwendige Isolation von PBMCs verzichtet, etabliert werden. Hinsichtlich seiner Detektionsleistung zeigte sich das Vollblutprotokoll dem PBMC Protokoll grundsätzlich überlegen. Für verschiedene Stimulationsperioden konnte ein gegenüber dem PBMC
Standardprotokoll reproduzierbarer Konversionsfaktor ermittelt werden, welcher einen Vergleich von Ergebnissen bei alternierender Durchführung von PBMC- und Vollblut-Assay bei den selben Patienten möglich macht. Das Protokoll erlaubt die Kombination von Stimulations- und Transportzeit unter Verwendung eines auf 37 °C temperierten Transportgefäßes. Eine alleinige Stimulation bei Raumtemperatur zeigte sich hingegen nicht erfolgreich. Die Anwendung des Assays am Point-of-Care wird durch die Verwendung vorbereiteter, marktüblicher Blutentnahmeröhrchen möglich, welche bis zum Zeitpunkt der Verwendung eingefroren gelagert werden können. Eine Analyse der Material- und Arbeitskosten ergab eine Reduktion der Gesamtkosten für die Verwendung des Vollblut-basierten Protokolls von bis zu 22 % pro Probe. Prinzipiell kann davon ausgegangen werden, dass der entwickelte Assay mit jedem Peptid-Antigen durchführbar ist, das in konstanter Qualität bezogen oder generiert werden kann und einen immunogenen Effekt aufweist, ohne dabei mit anderen verwendeten Reagenzien zu interagieren.
Weiterhin wurde in der vorliegenden Arbeit geprüft, wie sich T-Zell-inhibitorische Substanzen auf die Testergebnisse auswirken. Hierbei fand sich eine nicht unwesentliche Anzahl falsch-negativer Testergebnisse.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertationsschrift zeigen, dass eine suffiziente und sensitive Bestimmung A. fumigatus-spezifischer T-Zellen im Rahmen eines Vollblut-basierten Protokolls möglich ist. Eine Ausweitung des Assays für andere Infektionserreger, sowie die Entwicklung Brefeldin A-freier Protokolle wären wünschenswert. Ein mögliches Einsatzgebiet stellen klinisch infektiologische Studien oder umwelt- und arbeitsmedizinische Fragestellungen dar. / Over the past decades, the use of immunosuppressive therapies has led to an increasing incidence of invasive mycoses. Specifically, invasive aspergillosis, most commonly caused by Aspergillus fumigatus, is a life-threatening disease in hematopoietic stem cell transplant recipients and patients with hematologic malignancies. An early confirmation of the diagnosis is pivotal in order to improve therapeutic outcomes. As invasive diagnostic procedures are often contraindicated in high-risk patients, non-invasive diagnostic modalities and novel biomarkers for invasive mold infections are intensively studied.
A recently published method to diagnose and monitor invasive pulmonary aspergillosis utilizes flow cytometric quantification of mold-reactive T-helper cells by CD154 upregulation, an activation marker expressed on activated T cells. The published standard methodology to quantify these cells is based on isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
Among several limitations hampering the applicability of this method in the clinical routine, our group has previously shown that PBMC-based mold-reactive T-cell quantification is highly susceptible to pre-analytic delays. Therefore, my thesis focused on the optimization of pre-analytic sample handling prior to PBMC isolation in order to improve the detection efficacy of A. fumigatus-specific T-helper cells. Using agitation and dilution of blood samples prior to PBMCs isolation, the pre-analytic storage period could be extended to 4 hours without observing an adverse impact on assay sensitivity.
To overcome the many logistical limitations of PBMC-based assays, my thesis further focused on the evaluation and optimization of a whole blood-based method to quantify A. fumigatus-specific T-helper cells. Therefore, blood collection tubes containing costimulatory antibodies and an A. fumigatus mycelial lysates were prepared and inoculated with heparinized whole blood from healthy adults. Frequencies of CD154+ A. fumigatus-specific T-helper cells were then compared with PBMC-based detection rates. Using optimized stimulation schemes for both matrices, significantly higher specific T-cell detection rates were achieved by the whole blood-based method. Excellent correlation and reproducible conversion factors between whole blood- and PBMC-based results were observed. Using frozen ready-to-use test tubes, detection rates of specific T cells were comparable to those observed with freshly prepared tubes. Taken together, these results suggest that our whole blood protocol provides a robust, highly sensitive, and cost-effective method for mold-reactive T-cell quantification. Our protocol allows for point-of-care sample stimulation and may contribute to better assay standardization for multi-center studies of mold reactive T-cell assays.
Lastly, my thesis focused on the impact of T-cell-inhibitory immunosuppressive pharmacotherapy on A. fumigatus specific T-cell quantification. My results revealed significantly reduced mean detection rates of specific T-cells and considerable inter-individual variation in assay reliability upon exposure of PBMC samples to cyclosporine A, mycophenolic acid, and prednisolone. These findings suggest that false-negative results need to be considered when performing this test in immunosuppressed patient cohorts and inspired further studies of our group to attenuate the detrimental impact of immunosuppressive agents on assay performance by enhanced costimulation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:21340 |
| Date | January 2020 |
| Creators | Helm, Johanna Charlotte |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_mit_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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