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Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / O astrocitoma grau IV ou glioblastoma multiforme (GBM) é o mais maligno e com prognóstico ruim entre os gliomas. Esse prognóstico sombrio está associado, em parte, à quimiorresistência (QR). Ao lado disso, a classificação atual dos gliomas não consegue responder a heterogeneidade da resposta ao tratamento. Assim, parece existir subtipos de GBM com características distintas. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi caracterizar fenotipicamente uma nova linhagem, ESP12, e, desenvolver um modelo in vitro para a avaliação da QR. Amostras obtidas de glioma humano foram estudadas quanto aos achados característicos de malignidade e subtipadas quanto aos fenótipos proliferativo e pró-neural, imunohistoquimicamente. As culturas obtidas das amostras foram mantidas a 37 ºC em atmosfera com 5% de CO2. A caracterização de ESP12 incluiu: a) subtipagem por imunocitoquímica e por citometria de fluxo; b) investigação de um fenótipo de resistência, através da identificação de células CD133+ e de proteínas de resistência às múltiplas drogas, glicoproteína-P (Pgp) e MRP1; c) avaliação da cinética de crescimento, através da determinação do tempo de duplicação celular (TDPC); d) verificação da produção do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); e) avaliação da viabilidade celular, através do teste com MTT, quando exposta a carmustina (BCNU), a vimblastina (VIM) e a temozolomida (TMZ). Por fim, investigamos a atividade quimiossensibilizante do 8-metoxipsoraleno (8-MOP) utilizando o modelo estabelecido. Foram obtidos 6 casos de GBM e 3 casos de gliomas de graduação III, pela Organização Mundial de Saúde, com idade média de 52,6 14,1 anos, a maioria homens. As manifestações clínicas mais frequentes foram crises convulsivas e cefaleia, e, a localização tumoral foi variada. Os achados de imagem se correlacionaram com os achados histoquímicos confirmando o diagnóstico. A sobrevida dos pacientes variou entre 11 dias e 24 meses, com mediana de 11,5 meses. As células formaram monocamadas e revelaram intenso pleomorfismo. A maior parte das amostras apresentou fenótipo proliferativo na imunohistoquímica. As proteínas que caracterizam os fenótipos pró-neural, proliferativo e mesenquimal foram detectadas tanto por imunohistoquímica quanto por imunocitoquímica, em ESP12. Quantitativamente, o fenótipo proliferativo foi mais evidente detectado por citometria de fluxo. Células CD133+ representaram menos que 1%. Além disso, 38,6% das células foram positivas para a Pgp. Não houve diferença entre a produção do
VEGF por ESP12 quando comparada a outras linhagens de GBM já estabelecidas. O TDPC de ESP12 foi de 31 h. ESP12 se mostrou mais sensível do que outras linhagens de GBM já estabelecidas a BCNU, a VIM e a TMZ. Por fim, o 8-MOP mostrou atividade quimiossensibilizante significativa. / The astrocytoma grade IV also known as glioblastoma multiforme (GBM) is the most malignant and has a poor prognosis among gliomas. This poor prognosis is associated, in part, to chemoresistance (QR). Furthermore, the current classification of gliomas cannot answer the heterogeneity of treatment response. Therefore, it seems to exist GBM subtypes with distinct characteristics. The aim of this study was to characterize phenotypically a new cell line, ESP12, and to develop an in vitro model for the assessment of QR. Human glioma samples were studied by immunohistochemistry for the characteristic findings of malignancy and subtyped as to proliferative and proneural phenotypes. Primary cultures were obtained from samples and maintained at 37 °C in an atmosphere with 5% CO2. The characterization of ESP12 included: a) subtyping by immunocytochemistry and flow cytometry; b) investigation of a resistance phenotype by identifying CD133+ cells and the multidrug resistance proteins, P-glycoprotein (Pgp) and MRP1; c) evaluation of the growth kinetics, by determining the cell doubling time (TDPC); d) assaying of vascular endothelial growth factor (VEGF) production; e) the assessment of cell viability by the MTT test after exposure to carmustine (BCNU), vinblastine (VIM), and temozolomide (TMZ). Finally, we investigated the chemosensibilizing activity of 8-methoxypsoralen (8-MOP) using the established model. Six cases of GBM and 3 cases of grade III gliomas were obtained, with a mean age of 52.6 14.1 years, mostly men. The most common clinical manifestations were seizures and headache, and the tumor location was varied. Imaging findings were correlated with the histochemical findings confirming the diagnosis. The median survival was 11.5 months (range: 11 days to 24 months). The cells formed monolayers and showed intense pleomorphism. Most samples showed proliferative phenotype in immunohistochemistry. Proteins that characterize the proneural, proliferative and mesenchymal phenotypes were detected both by immunohistochemistry and by immunocytochemistry on ESP12. The proliferative phenotype was more quantitatively evident by flow cytometry. CD133+ cells represented less than 1%. Moreover, 38.6 % of cells were positive for Pgp. There was no difference between the production of VEGF between ESP12 and other GBM cell lines already established. The TDPC of ESP12 was 31 h. ESP12 was more sensitive than other cell lines already established of GBM to BCNU, TMZ and VIM. Finally, the 8-MOP showed significant chemosensibilizing activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/8176 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Lima, Rute Maria Ferreira |
| Contributors | Strauss, Bryan Eric, Reis, Rui Manuel, Santos, Jean Nunes dos, Bezerra, Daniel Pereira, El-Bachá, Ramon dos Santos |
| Publisher | Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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