Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-09-20T16:47:37Z
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2016_LorenaCardosoCintra.pdf: 15762332 bytes, checksum: de12e23f747150193dbbfe502dc41117 (MD5) / A lignocelulose é o principal componente da biomassa vegetal, sendo constituída por celulose, hemicelulose e lignina. A xilana é o principal componente da hemicelulose e para a sua completa degradação é necessário a ação cooperativa de um sistema composto por várias enzimas, incluindo endo-xilanases (XYN), β-xilosidases (XYL) e α-L-arabinofuranosidases (ABF). No presente trabalho, foi realizada a produção de hemicelulases recombinantes e a aplicação na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar (BCA) pré-tratado por explosão a vapor. As primeiras enzimas produzidas foram duas XYLs do fungo Humicola grisea var. thermoidea, sendo esse o primeiro trabalho a reportar a caracterização de genes de XYLs de H. grisea, bem como, a sua expressão heteróloga e caracterização bioquímica. Os dois genes, hxylA e hxylB, foram identificados a partir do genoma de H. grisea, um com 984 pb e outro com 1617 pb, respectivamente. Nenhum íntron e peptídio sinal foi encontrado e o domínio catalítico de GH43 estava presente em ambas. Os cDNAs correspondente as duas enzimas foram utilizados para a transformar duas linhagens de Pichia pastoris, GS115 e SMD1168. Uma otimização da produção da enzima denominada HXYLA foi realizada por meio de planejamento experimental 23. A influência da densidade celular inicial, concentração de metanol e fonte de nitrogênio foi avaliada e o parâmetro mais significativo para a produção foi a concentração de metanol. A enzima HXYLA purificada foi utilizada para a realização da caracterização enzimática quanto ao pH e temperatura ótimos (7,0 e 50 °C), efeito de íons e reagentes químicos na atividade de HXYLA, substrato específico e parâmetros cinéticos. A enzima HXYLA apresentou atividade de β- xilosidase e α-L-arabinofuranosidase, sendo uma enzima bifuncional e altamente tolerante a xilose, com elevado valor de Ki (350 mM). Além das β-xilosidases, foi produzida e purificada uma endoxilanase (HXYN2) recombinante de H. grisea a partir de um clone de P. pastoris obtido pelo grupo de pesquisa do laboratório de Biotecnologia de Fungos (LBF/UFG). Além dessas hemicelulases, uma α- L-arabinofuranosidase (ABF3) de Penicillium purpurogenum teve seu cDNA introduzido em P. pastoris e a enzima foi produzida com sucesso. Após a produção hetoróloga das enzimas, foi utilizado um planejamento experimental 23 para avaliar a melhor formulação contendo as três hemicelulases recombinantes (HXYN2, ABF3 e HXYLA) para a hidrólise do BCA pré-tratado por explosão a vapor, sendo possível estabelecer uma mistura capaz de realizar a conversão da fração residual de xilana em xilose, sendo a bioconversão eficiente da fração de xilana do BCA uma etapa imprescindível para o aproveitamento da xilose. A melhor formulação contendo as três hemicelulases recombinantes foi obtido com a menor concentração de ABF3, sendo que essa enzima foi a que exerceu efeito mais significativo durante a hidrólise do BCA. Além disso, o coquetel contendo as hemicelulases recombinantes foi utilizado para suplementar uma mistura de celulases comerciais aumentando significativamente a liberação de glicose a partir do BCA, o que mostrou a capacidade das hemicelulases de melhorar a digestibilidade de celulose e tornar o processo de hidrólise mais eficiente. Nossos resultados mostram o potencial de atividades acessórias para aumentar a hidrólise enzimática, tais como XYNs, ABFs e XYLs, que estão ausentes ou presentes em pequenas proporções nas celulases comerciais. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Lignocellulose is the main component of plant biomass, which consists of cellulose, hemicellulose and lignin. Xylan is the main component of hemicellulose and for its complete degradation is required cooperative action of a system consisting of several enzymes including endo-xylanases (XYN), β- xylosidases (XYL) and α-L-arabinofuranosidases (ABF). In the present work, the production of recombinant hemicellulases and its application in the hydrolysis of sugarcane bagasse (SCB) pretreated by steam explosion was performed. The first enzymes produced were two XYLs from Humicola grisea var thermoidea and this was the first study to report the genes characterization of XYLs from H. grisea, as well its heterologous expression and biochemical characterization. The two genes, hxylA and hxylB, were identified from the H. grisea genome, with 984 bp and 1617 bp, respectively. No intron and signal peptide were found and the GH43 catalytic domain was present in both. The cDNAs of both enzymes were used to transform two strains of Pichia pastoris, GS115 and SMD1168. A production optimization of enzyme denominated HXYLA was performed by a 23 factorial design. The influence of the initial cell density, methanol concentration and nitrogen source was assessed and the most significant parameter for the HXYLA production was methanol concentration. The purified enzyme was used to carry out the enzymatic characterization as optimal pH and temperature (7.0 and 50 °C), effect of ions and chemical reagents in HXYLA activity, substrate specific and kinetic parameters. HXYLA is a bifunctional enzyme, displaying β-xylosidases and α-Larabinofuranosidases activity, also that enzyme was highly tolerant xylose with high Ki value (350 mM). In addition to β-xylosidases, a recombinant endo-xylanase (HXYN2) from H. grisea was produced and purifield from a P. pastoris clone obtained by the research group from Fungal Biotechnology Laboratory (LBF/UFG). It was also produced one α-L-arabinofuranosidases (ABF3) from Penicillium purpurogenum which had its cDNA introduced in P. pastoris and the enzyme has been successfully produced. After the production of these enzymes, a 23 factorial design was used to evaluate the best formulation containing the three recombinant hemicellulases (HXYN2, ABF3 and HXYLA) for the SCB pretreated by steam explosion hydrolysis. It was possible to formulate a mixture capable to performing the conversion of the xylan fraction in the xylose, being efficient bioconversion of SCB xylan fraction an essential step for the utilization of xylose. The best formulation containing these three recombinant hemicellulases was obtained with the lowest concentration of ABF3, and it had most significant effect exerted during SCB hydrolysis. Also, the cocktail containing recombinant hemicellulases was used to supplement a mixture of commercial cellulase and it showed significantly increasing the release of glucose from the SCB hydrolysis, which showed the ability of hemicellulases to improve the digestibility of cellulose and make the hydrolysis process more efficient. Our results showed the potential for auxiliary activities to increase the enzymatic hydrolysis, such as XYNs, ABFs and XYLs who are absent or present in small amounts in comercial cellulases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/21848 |
| Date | 31 May 2016 |
| Creators | Cintra, Lorena Cardoso |
| Contributors | Faria, Fabrícia Paula de, Ulhoa, Cirano José |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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