RNA-bindande proteiner (RBP:er) har framträtt som kritiska regulatorer i post-transkriptionell genreglering, och deras dysreglering bidrar till cancerpatogenes. CAPRIN1, ett cytoplasmiskt protein, har identifierats som ett onkofetalt RBP med potentiell betydelse i hepatocellulärt karcinom (HCC), en mycket malign form av levercancer med dålig prognos. Detta examensarbete syftade till att använda gensredigeringsteknologier som CRISPR-interferens (CRISPRi) och RNA-interferens (RNAi) för att störa CAPRIN1-uttryck i HCC-cellinjer och analysera dess effekter på cellproliferation och mängden av CAPRIN1:s främsta RNA-mål. CRISPRi-konstruktioner som riktade sig mot transkriptionsstartstället (TSS) av CAPRIN1 designades och validerades, men trots lyckad kloning och uttryck av guideRNA:er (gRNA:er) resulterade CRISPRi-medierad gensläckning (KD) inte i någon signifikant minskning av CAPRIN1-uttryck. Ineffektiviteten hos CRISPRi tillskrevs låg transfektionseffektivitet, vilket bekräftades av fluorescensmikroskopi med EGFP-expressande plasmider i HepG2- och Huh7-celler. Detta kräver ytterligare optimering av elektroporationsparametrar eller utforskning av alternativa leveransmetoder. I kontrast uppnådde RNAi-medierad KD en betydande minskning av CAPRIN1-uttryck, vilket visade hög KD-effektivitet (90%) enligt RT-qPCR. Denna nivå av gensläckning gav en robust modell för vidare analyser. Efterföljande RT-qPCR av sex topp-RNA-mål identifierade av RAPseq visade varierande svar, med oväntad uppreglering av MYC och Cyclin D2, vilket går emot litteratur som antyder att deras stabilitet beror på CAPRIN1. Denna diskrepans kan förklaras av betydande standardavvikelse i uttrycksnivåerna, vilket understryker behovet av att upprepa experimenten samt genomföra en transkriptomanalys med RNA-seq för att identifiera meningsfulla mål såsom långa icke-kodande RNA (lncRNA:er). Ytterligare, MTT-proliferationstester, visade ökad cellproliferation efter CAPRIN1-KD, även om experimentella inkonsekvenser såsom ojämna cellantal begränsade slutsatsernas pålitlighet. För att erhålla tillförlitliga resultat behöver dock MTT-testet upprepas för att säkerställa konsistens med den positiva kontrollen och samla in statistiskt signifikanta data.Sammanfattningsvis, trots att CRISPRi-försöket stötte på betydande utmaningar, kan gRNA-designen och klonade plasmider användas i framtida studier när elektroporationsprotokollet har optimerats. Dessutom visade den framgångsrika RNAi-medierade KD av CAPRIN1 en alternativ metod som kan antas för vidare studier med andra RBP-kandidater. Framtida studier bör syfta till att optimera elektroporationssystemet, validera KD på proteinnivå och använda RNA-seq för en omfattande analys av CAPRIN1:s inverkan på transkriptomet i HCC-cellinjer. Dessa ansträngningar kommer att förbättra förståelsen av CAPRIN1:s regulatoriska mekanismer och dess potential som terapeutiskt mål vid HCC. / RNA-binding proteins (RBPs) play a crucial role in post-transcriptional gene regulation, and their dysregulation is implicated in cancer pathogenesis. CAPRIN1, a cytoplasmic activation/proliferation-associated protein, identified as an oncofetal RBP with potential significance in hepatocellular carcinoma (HCC), is a worthy candidate to be studied. Objective: This project aimed to establish a protocol for silencing RBPs gene expression via CRISPR interference (CRISPRi) technology using CAPRIN1 as a case study, as the roles of CAPRIN1 in tumorigenesis remains unknown. Results: Despite successful cloning of the designed gRNAs, CRISPRi-mediated knockdown did not reduce CAPRIN1 expression, attributed to low transfection efficiency as indicated by fluorescence microscopy. RNAi-mediated knockdown, however, achieved substantial reduction in CAPRIN1 expression (90%). Subsequent analysis of CAPRIN1 top RNA interactors showed substantial standard deviations, highlighting the need for repeating the experiments. The MTT assay showed uneven initial seeding densities, necessitating further repetitions of the assay. Conclusions: The study highlights the challenges associated with CRISPi-mediated knockdown, especially in transfecting HepG2 cells with large plasmids using electroporation. However, the designed gRNAs and cloned plasmids have the potential to be used in future studies, provided that the transfection process is further optimized. RNAi proved to be an effective alternative for gene silencing, achieving high knockdown efficiency and enabling subsequent analysis of CAPRIN1 target RNAs. Prioritizing further optimization of CRISPRi transfection protocols in upcoming projects will facilitate the adoption of this workflow for investigating other RBP candidates. Additionally, performing a comprehensive RNA-seq analysis could provide a deeper understanding of CAPRIN1’s role in HCC.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-348505 |
| Date | January 2024 |
| Creators | Nasirzadeh Yazdi, Arash |
| Publisher | KTH, Proteinvetenskap |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2024:129 |
Page generated in 0.0031 seconds