Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado que ao infectar seres humanos causa a doença de Chagas, uma doença tropical negligenciada que afeta milhões de pessoas no mundo todo. As fumarato hidratases (FH), ou fumarases, são enzimas que catalisam a reação estéreo-específica reversível de hidratação do fumarato em S-malato, e foram recentemente consideradas essenciais para a viabilidade do parasito Trypanosoma brucei, sugerindo seu potencial como alvo macromolecular para o desenvolvimento de novos fármacos tripanocidas. O presente trabalho visou à caracterização funcional, bioquímica, biofísica e estrutural das fumarases de T. cruzi (TcFHs) e humana (HsFH) de forma a avaliar o papel das TcFHs para o parasito Trypanosoma cruzi, mapear o mecanismo de ação e identificar as diferenças entre TcFHs e a enzima humana de forma a serem exploradas no planejamento de inibidores seletivos às fumarases do parasito. Análise das sequências mostrou que TcFHs pertencem à classe I das fumarases (enzimas diméricas dependentes de ferro) e não são homólogas à HsFH que pertence a classe II (tetraméricas independentes de ferro). Estudos de localização celular confirmaram a existência de duas fumarases em T. cruzi, uma citosólica (TcFHc) e uma mitocondrial (TcFHm), e experimentos de nocaute gênico sugeriram que essas enzimas são essências para o parasito. A caracterização cinética das enzimas TcFHc, TcFHm e HsFH mostrou que as fumarases de T. cruzi são sensíveis ao oxigênio enquanto a enzima humana se mantém ativa em condições aeróbicas. Estudos de ressonância eletrônica paramagnética mostraram a presença de um cluster de ferro-enxofre, sensível a oxidação por oxigênio, envolvido no mecanismo enzimático das enzimas TcFHs. Modelos estruturais das TcFHs, construídos por homologia à estrutura cristalográfica da fumarase de Leishmania major, foram comparados à estrutura cristalográfica obtida para a fumarase humana e as diferenças entre as duas estruturas foram utilizadas no planejamento de ligantes seletivos às fumarases do parasito. O ligante planejado inibiu a fumarase citosólica de T. cruzi na faixa de 1 ?M e não apresentou efeito na atividade da enzima humana. Testes in vivo demonstraram o efeito tripanocida do inibidor provavelmente por interferir na produção de ATP pela mitocôndria do T. cruzi. Os resultados obtidos com o desenvolvimento desse projeto apresentam uma proposta inovadora no desenvolvimento de novas terapias contra a doença de Chagas, o uso da enzima fumarase como alvo macromolecular, assim como apresenta um inibidor potente e seletivo para a enzima do parasito a ser utilizado como protótipo no desenvolvimento de fármacos contra Trypanosoma cruzi. A síntese de moléculas análogas ao inibidor de forma a melhorar suas propriedades farmacológicas encontra-se em andamento / Trypanosoma cruzi is a flagellate protozoan parasite that infects humans and causes Chagas disease, a tropical neglected disease that affects millions of people worldwide. Fumarate hydratases (FH), or fumarases, are enzymes responsible for the reversible stereo-specific hydration of fumarate into S-malate, and were recently considered to be essential to Trypanosoma brucei viability, suggesting, therefore, a potential role for FHs as macromolecular targets to the drug development against trypanosomatids. The present work focused on the functional, biochemical, biophysical and structural characterization of T. cruzi fumarases (TcFHs) and human fumarase (HsFH) to evaluate TcFHs role for T. cruzi, map the reaction mechanism and identify and exploit differences between the parasite and host enzymes in order to design selective inhibitors to the parasite enzyme. Sequence analysis revealed that TcFHs belong to class I fumarases (dimeric and iron-sulfur containing enzymes) and are not homologous to HsFH which belongs to class II fumarases (tetrameric iron independent enzymes). Cellular sub-localization studies confirmed the presence of a cytosolic and a mitochondrial fumarases in T. cruzi and gene knockout experiments suggested TcFHs are essential to the parasite. The kinetic characterization showed that TcFHs activity is highly sensitive to oxygen whereas HsFH activity remained stable in aerobic conditions. Electron paramagnetic experiments further revealed the presence of an iron-sulfur cluster highly sensitive to oxidation and involved in the catalytic mechanism in both TcFHm and TcFHc. TcFHs structural models, built by homology modeling using the Leishmania major fumarase crystal structure as template, were compared to the HsFH crystal structure and the differences were used to design a selective ligand to the parasite fumarases. The designed ligand showed to inhibit TcFHc with an IC50 of 1 ?M and showed no effect on the human fumarase activity. In vivo assays using T. cruzi epimastigotes demonstrated the trypanocidal effect of the designed inhibitor probably caused by stalling ATP production. The results obtained with the development of this project represent an innovative proposal on the development of new therapies against Chagas disease, the use of fumarase enzyme as a macromolecular target, as well as present a potent and selective inhibitor to the parasite enzyme to be further used as a prototype in the development of drugs against Chagas disease. The synthesis of inhibitor analogues with optimized pharmacological properties are currently in progress.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-15052014-084203 |
| Date | 14 March 2014 |
| Creators | Ricardo Augusto Pereira de Pádua |
| Contributors | Maria Cristina Nonato Costa, Glaucius Oliva, Ariel Mariano Silber, Richard John Ward, Shane Robert Wilkinson |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Farmacêuticas, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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