As principais matérias primas necessárias para a preparação de testes diagnósticos são as proteínas dos patógenos que necessariamente apresentem as estruturas nativas. O objetivo do presente estudo foi a obtenção das proteínas não estruturais 1 (NS1) dos vírus da dengue (DENV) e da zika (ZIKV) a partir dos corpúsculos de inclusão (CI) produzidos em bactérias Escherichia coli. Mostramos que a combinação de alta pressão hidrostática (APH) e pH alcalino é eficiente para a solubilização de NS1-CI. A incubação em 2,4 kbar das suspensões de NS1-CI em pH alcalino mostrou-se eficiente para a solubilização da NS1. A presença de Arg promove a dissociação de oligômeros. A aplicação de 2,4 kbar às suspensões de NS1-CI em pH de 10,5 (DENV) e de 11,5 (ZIKV) na presença de Arg e um par redox, seguida de diálise em tampão em pH 8,5, foram as condições escolhidas para o reenovelamento de NS1. Obtivemos ambas NS1 com rendimentos entre 75% e 90% em relação às quantidades totais das proteínas presente nos correspondentes CI de NS1. As NS1 reenoveladas apresentaram reatividade comparável às proteínas obtidas utilizando um protocolo convencional estabelecido, com rendimentos mais de 25 vezes superiores. Foi obtido um processo altamente eficiente para o reenovelamento de NS1 apresentando características biológicas preservadas em relação a reatividade com anticorpos específicos de antígeno, incluindo soro de paciente infectado com zikv e que, portanto, podem ser usados como antígeno para o desenvolvimento de vacinas ou testes de diagnóstico. Além disso, este estudo descreve a criação de um processo inovador, que é a utilização concomitante de APH e pH alcalino, para solubilização e posterior reenovelamento de NS1-CI que podem ser utilizados para outras proteínas relevantes. / The main products for the preparation of diagnostic tests are as proteins of the pathogens that necessarily present as the native structures. The objective of the present study was to obtain non-structural proteins 1 (NS1) from dengue virus (DENV) and zika virus (ZIKV) from the inclusion bodies (IBs) produced in Escherichia coli bacteria. We show that it is a combination of high hydrostatic pressure (HHP) and alkaline pH is efficient for a solubilization of NS1-IB. A 2.4 kbar incubation of NS1-IB suspensions at alkaline pH proved to be efficient for NS1 solubilization. The presence of Arg promotes the dissociation of oligomers. The application of 2.4 kbar to the suspensions of NS1-IB at pH 10.5 (DENV) and 11.5 (ZIKV) in the presence of Arg and a redox pair, dialysis in pH 8.5 buffer were as conditions chosen for the refolding of NS1. We obtained both NS1 at yields between 75% and 90% relative to the total amounts of the proteins present in the corresponding NS1 IB. Refolded NS1 showed similar to proteins obtained using an established standard protocol, with yields more than 25 times higher. A highly efficient process for the refolding of NS1 was obtained with preserved biological features regarding reactivity with antigen-specific antibodies, including sera of zikv-infected patients and that can be used as antigen for the development of vaccines or diagnostic tests. In addition, this study describes the creation of an innovative process, which is a concomitant use of HHP and alkaline pH, for solubilization and subsequent refolding of NS1-IB that can be used for other relevant proteins.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-26102017-123523 |
| Date | 11 August 2017 |
| Creators | Silva, Cleide Mara Rosa da |
| Contributors | Dias, Ligia Ely Morganti Ferreira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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