Hintergrund:
Das Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziale-Syndrom (BWCFF-S) gehört mit einer Prävalenz von 1:1.000.000 zu den sehr seltenen genetischen Krankheiten und wird durch Missense-Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1, die die zytoplasmatischen Aktin-Isoformen βCYA und γCYA kodieren, verursacht. Neben multiplen fazialen Dysmorphien und Skelettfehlbildungen weisen bis zu 70 % der Patient*innen kortikale Malformationen wie Mikrozephalie und Lissenzephalie auf, deren ursächlichen Pathomechanismen bisher noch nicht erforscht wurden. Ebenso wenig ist über das Expressionsmuster von βCYA und γCYA im humanen Gehirn während der embryonalen Entwicklung bekannt. Die Generierung von zerebralen Organoiden durch Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPS-Zellen), die aus primären Zellen von Patient*innen reprogrammiert werden können, eröffnet neue Möglichkeiten, die Neurogenese und Kortikogenese zu studieren sowie zelluläre Krankheitsmodelle zu entwickeln.
Material und Methoden:
Das Expressionsmuster von βCYA und γCYA wurde mittels Immunfluoreszenz in humanem fetalem Gehirngewebe sowie zerebralen Organoiden charakterisiert. Aus den iPS-Zelllinien der BWCFF-S-Patientinnen mit Mutationen in jeweils einem Aktin-Gen (ACTB p.Thr120Ile und ACTG1 p.Thr203Met) sowie gesunden Kontrollen wurden unter der Verwendung von zwei Protokollen nach gerichteter und ungerichteter Differenzierung zerebrale Organoide generiert und diese charakterisiert. Mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems wurden die gleichen Mutationen in ACTB und ACTG1 in iPS-Zellen der Kontroll-Zelllinien CRTDi011-A und SC102A-1 editiert. Zerebrale Organoide, die nach dem ungerichteten Protokoll differenziert wurden, wurden durch Immunfluoreszenz- und TEM-Analysen hinsichtlich ihrer Zytoarchitektur, Zelltypen und Aktin-Verteilung untersucht. Außerdem wurden Apoptose, Proliferation und Ausrichtung der Zellteilungsebenen der apikalen Progenitorzellen analysiert. Unter Verwendung der RNA-Einzelzell-Sequenzierung wurden die Zellpopulationen von zerebralen BWCFF-S- und Kontroll-Organoiden an zwei unterschiedlichen Kultivierungs-Zeitpunkten analysiert. Zudem wurden Kontroll-iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) differenziert, um die intrazelluläre Lokalisierung der Aktin-Isoformen mit Immunfluoreszenz-Analysen zu bestimmen. Unter Durchführung von Migrationsassays mit Neurospäroiden und zerebralen Organoiden wurden die Migrationseigenschaften der neuralen BWCFF-S-Zellen untersucht.
Ergebnisse:
In dieser Arbeit wurde das Expressionsmuster der Aktin-Isoformen βCYA und γCYA im humanen fetalen Gewebe, in zerebralen Organoiden sowie in NPCs und Neuronen analysiert. Im humanen fetalen Gewebe und in den zerebralen Organoiden zeigte sich ein überlappendes Expressionsmuster von beiden Isoformen in allen Schichten des Neokortex. Im Gegensatz dazu wiesen Immunfluoreszenz-Färbungen in kultivierten NPCs und Neuronen eine Isoform-spezifische Lokalisierung von βCYA und γCYA auf, mit einer Anreicherung von βCYA im Zellkortex und in den Zellfortsätzen der NPCs, wohingegen γCYA im Zytosol angereichert war. In Neuronen wurde eine stärkere Lokalisierung von βCYA im Wachstumskegel und von γCYA in den Neuriten festgestellt.
Zudem wurde die Kultur zerebraler Organoide für die Modellierung des BWCFF-S erfolgreich etabliert. BWCFF-S-Organoide waren im Vergleich zur Kontrolle in ihrer Gesamtgröße signifikant reduziert und zeigten auch kleinere ventrikulären Zonen (VZs) in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Als Ursache für diese Größenunterschiede konnte die veränderte Ausrichtung der Teilungsebene der apikalen Progenitorzellen (APs) in der Anaphase von vertikal zu horizontal und damit der Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung festgestellt werden, im Zusammenspiel mit einer abnormalen Anreicherung von Mikrotubuli an der ventrikulären Oberfläche in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung der zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoide zeigte eine Veränderung der Zellpopulation mit einer reduzierten Anzahl von radialen Gliazellen (RGs) und Neuronen in den BWCFF-S-Organoiden. Die BWCFF-S-ähnlichen Organoide mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile, die durch Gen-Editierung der Kontroll-Zelllinie CRTDi011-A generiert wurden, zeigten nahezu in allen Analysen vergleichbare Ergebnisse wie die Patientinnen-eigenen BWCFF-S-Organoide mit derselben Mutation und belegten somit, dass sich durch Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems isogene Kontrollen herstellen lassen. Durch Migrationsassays mit Neurosphäroiden und Organoiden konnte eine gravierend veränderte Migration der neuralen BWCFF-S-Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt werden.
Schlussfolgerung:
Die Modellierung des BWCFF-S in den zerebralen Organoiden entschlüsselte den zellulären Pathomechanismus der mikrozephalen kortikalen Malformation. Die Veränderung der Ausrichtung der mitotischen Spindel in den APs und dem dadurch entstehenden Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung führt zu einer Reduktion des Progenitorzellpools und einer verfrühten Neurogenese. Die verringerte Anzahl der Progenitorzellen in der VZ der zerebralen Organoide spiegelt sich in der verminderten Größe der VZs wider. Beide BWCFF-S-assoziierten Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1 führten zu einer veränderten Ausrichtung der Teilungsebene in den APs. Die deutliche Einschränkung der neuralen Migration wurde jedoch nur bei Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt, was einen ersten Hinweis auf die Isoform-spezifische Funktion der beiden Aktinproteine liefert.:Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis V
Abbildungsverzeichnis X
Tabellenverzeichnis XIII
1. Einleitung 1
1.1. Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziales-Syndrom 1
1.1.1. Das klinische Bild und genetische Ursachen 1
1.1.2. Neurologische Symptome und kortikale Malformationen beim BWCFF-S 3
1.2. Aktin 5
1.2.1. Die sechs Aktin-Isoformen 5
1.2.2. Das Aktin-Zytoskelett 5
1.2.3. Die Funktionen des Aktin-Zytoskeletts 8
1.2.4. Das Aktin-Zytoskelett im zentralen Nervensystem (ZNS) 10
1.3. Neuro- und Kortikogenese des humanen Gehirns 12
1.4. Zerebrale Organoide als Modellsysteme für neurologische Entwicklungsstörungen 15
1.5. Ziele dieser Arbeit 20
2. Material 21
2.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien 21
2.2. Chemikalien und Kits 23
2.3. Lösungen für die Molekularbiologie 25
2.4. Medien für die Zellkultur 25
2.5. Puffer und Lösungen für Immunfluoreszenz-Analysen 27
2.6. Primer 28
2.7. Guide RNAs (gRNAs), Templates und Cas9 28
2.8. Primäre Antikörper 29
2.9. Sekundäre Antikörper und DNA-Fluoreszenzfarbstoff 30
2.10. Zelllinien 30
2.11. Humanes fetales Gehirngewebe 32
2.12. Software 33
3. Methoden 34
3.1. Molekularbiologische Methoden 34
3.1.1. DNA-Isolierung 34
3.1.2. Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) 34
3.1.3. Gelelektrophorese 35
3.1.4. Aufreinigung der PCR-Produkte 35
3.1.5. Sanger-Sequenzierung 36
3.2. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) 36
3.2.1. Reprogrammierung von dermalen Fibroblasten in iPS-Zellen 36
3.2.2. Kultivierung der iPS-Zellen 37
3.2.3. Gen-Editierung der iPS-Zellen mit CRISPR/Cas9 37
3.3. Differenzierung von iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neurone 39
3.3.1. Kultivierung von Neuronen im XonaChip® 39
3.4. Differenzierung von iPS-Zellen in Vorderhirn-Organoide (forebrain organoids) 40
3.5. Differenzierung von iPS-Zellen in zerebrale Organoide (whole brain organoids) 42
3.6. Migrationsassay mit Neurosphäroiden 43
3.7. Migrationsassay mit zerebralen Organoiden (radiale Migration) 44
3.8. Immunfluoreszenz-Analysen 44
3.8.1. Färbeprotokoll für βCYA und γCYA in Einzelzellen, Organoiden und humanem fetalem Gewebe 45
3.8.2. Protokoll für Immunfluoreszenz-Färbungen mit Antigen-Demaskierung durch Sieden 45
3.9. Mikroskopie 46
3.10. Bildanalyse und Datenerhebung 46
3.10.1. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen für die Analyse der Verteilung von βCYA und γCYA in Einzelzellen, zerebralen Organoiden und humanem fetalen Gehirngewebe 46
3.10.2. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen von Einzelzellen und zerebralen Organoide 47
3.10.3. Quantifizierungen verschiedener Größen der zerebralen Organoide 47
3.10.4. Bildbearbeitung der Aufnahmen der zerebralen Organoide nach dem Migrationsassay 49
3.11. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) 49
3.12. RNA-Einzelzell-Sequenzierung von zerebralen Organoiden 50
3.13. Analyse der RNA-Einzelzell-Sequenzierdaten der zerebralen Organoide 50
3.14. Statistik 51
4. Ergebnisse 53
4.1. Bestätigung der pathogenen Aktin-Varianten in den Patientinnen-spezifischen iPS- und editierten iPS-Zelllinien 53
4.2. Die beiden Aktin-Isoformen βCYA und γCYA zeigen ein überlappendes Expressionsmuster im humanen fetalen Gewebe des Neokortex 55
4.3. Isoform-spezifische intrazelluläre Anreicherung von βCYA und γCYA in neuralen Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neuronen 58
4.4. Gehirn-Organoide als Krankheitsmodell für die BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 62
4.4.1. Das Vorderhirn-Protokoll konnte nicht reproduziert werden 62
4.4.2. Differenzierung von Kontroll- und BWCFF-S-iPS-Zelllinien in zerebrale Organoide nach dem Lancaster-Protokoll und erfolgreiche Etablierung des Organoidmodells für Analysen des zellulären Pathomechanismus des BWCFF-S 63
4.5. Zerebrale BWCFF-S-Organoide rekapitulieren die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 64
4.5.1. Die Analyse der Lokalisierung von βCYA und γCYA zeigt keine Unterschiede zwischen zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoiden und ist ähnlich der Verteilung im humanen fetalen Neokortex 67
4.5.2. Zerebrale BWCFF-S-Organoide sind signifikant kleiner im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 70
4.5.3. BWCFF-S-Organoide zeigen eine signifikant verminderte Größe der Ventrikel-ähnlichen Strukturen mit reduzierter Anzahl der Progenitorzellen 75
4.5.4. BWCFF-S-Organoide zeigen keine Unterschiede in Proliferation und Apoptose im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 78
4.5.5. Apikale Progenitorzellen (APs) von BWCFF-S-Organoiden teilen sich vermehrt horizontal statt vertikal 81
4.5.6. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine Veränderung in der Ausrichtung der Zellteilungsebene im Vergleich zur Kontrolle 82
4.5.7. BWCFF-S-Organoide zeigen eine veränderte Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit apikaler Anreicherung von Mikrotubuli in Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)- und Immunfluoreszenz-Analysen 85
4.5.8. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine abnormale Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit einer Anreicherung von Mikrotubuli an der apikalen Oberfläche der VZ 89
4.6. BWCFF-S-NPCs zeigen ein abnormales Migrationsver-halten im Neurosphäroid-Migrationsassay 91
4.7. Zerebrale BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile zeigen kaum Migration von neuralen Zellen 93
4.8. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung zeigt Veränderungen in den Zellpopulationen von BWCFF-S-Organoiden und eine reduzierte Anzahl der RGs und Neurone 96
5. Diskussion 106
5.1. βCYA und γCYA zeigen in Gewebeschnitten des humanen fetalen Neokortex sowie zerebralen Organoiden ein überlappendes Expressionsprofil, weisen aber intrazellulär eine Isoform-spezifische Anreicherung auf 107
5.2. Zerebrale Organoide eignen sich für die Modellierung der mit dem BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 108
5.3. Die asymmetrische, horizontale Zellteilung von APs in BWCFF-S-Organoiden führt zu einer vorzeitigen Neurogenese und erklärt die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 110
5.4. Die Änderung der Orientierung der mitotischen Spindel in den apikalen Progenitorzellen weist auf eine gestörte Interaktion zwischen Mikrotubuli und dem Aktin-Zytoskelett hin 113
5.5. Die BWCFF-S-Organoide zeigen keine grundlegenden strukturellen Veränderungen der AJ 114
5.6. Editierte BWCFF-S-ähnliche Organoide mit cr. ACTB p.Thr120Ile zeigen eine ähnliche Pathologie wie BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile 115
5.7. Limitationen des zerebralen Organoidmodells müssen bei der Krankheitsmodellierung berücksichtig werden 117
5.8. Die BWCFF-S-Mutation ACTB p.Thr120Ile führt zu Migrationsstörungen von neuralen Zellen 119
5.9. BWCFF-S-Organoide haben eine reduzierte Anzahl von RGs und Neuronen 120
6. Ausblick 123
7. Zusammenfassung 125
8. Summary 128
9. Literaturverzeichnis 130
10. Anhang 142
10.1. Charakterisierung der reprogrammierten und editierten iPS-Zellklone 142
10.2. Auswertungsstrategie für die intrazelluläre Verteilung von βCYA und γCYA in NPCs und Neuronen 146
10.3. Werte der Winkel der Zellteilungsebenen der APs in der Anaphase 146
10.4. Immunfluoreszenz-Analysen des Adhäsions-Verbindungs-gürtels 148
10.5. Zusätzliche Daten der RNA-Einzelzell-Sequenzierung 149
11. Danksagung i
12. Veröffentlichungen iv
13. Erklärung zum Antrag auf Eröffnung des Promotionsverfahrens vi
14. Eidesstattliche Versicherung vii
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:85545 |
| Date | 25 May 2023 |
| Creators | Niehaus, Indra |
| Contributors | Dahmann, Christian, Zweier, Christiane, Di Donato, Nataliya, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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