Strukturbestämning av proteiner är viktigt för att kunna förstå deras funktion och en snabbt utvecklande metod inom fältet är kryoelektronmikroskopi. Storleksbegränsningar förhindrar en bredare applikation av metoden eftersom små proteiner har för låg signal i förhållande till bakgrund för att kunna visualiseras som enstaka partiklar i elektronmiksoskopibilder. Hypotesen för projektet är att det är möjligt att avbilda väldigt små proteiner och kringgå den konventionella storleksbegränsningen genom att använda ett bärarprotein ((Putrescine Aminotransferase; YgjG) som kopplas till en affibody (Zwt) genom “helical fusion” och sedan binda ett litet målprotein till denna större struktur. Komplexet ska ge en tillräcklig storlek, symmetri och rigiditet för en lyckad elektronmikroskopi av bärare tillsammans med det lilla icke kovalent bundna målproteinet. För att karaktärisera den föreslagna bäraren, genomförs stabilitetstester genom CD, verifiering av inbindning av målproteinet i SPR, renhetsundersökning med SEC och slutligen kryoelektronmikroskopi för att testa konceptet. Det lilla målproteinet som kommer att avbildas i konceptstudien är en annan affibody (Z963), som i så fall skulle vara det minsta proteinet som någonsin har lösts med kryogenelektronmikroskopi. Resultaten visar att den undersökta tetramera-bäraren är väldigt stabil (Tm~ 85 oC) och kan tolerera en affibody-fusion med bibehållen bindning av multipla säten. Proteinet kan uttryckas rekombinant och renas till högt utbyte och bildar tetramerer även med fuserad affibody. De slutgiltiga resultaten från den kryoelektronmikroskopiska analysen inväntas fortfarande, men lovande griddar har skapats och en partikelselektion har gett klara 2-D klasser som också framhäver att det lilla målproteinet har bundit. Sammanfattningsvis har biofysikalisk karaktärisering indikerat att YgjG är en lovande bas för ett “imaging scaffold” och att preliminära enstaka-partikel kryoelektronmikroskopi analyser visar att den föreslagna strategin att undersöka små målproteiner är möjlig. / Determining structures of proteins is important to understand protein functions, and a rapidly evolving technique in this field is cryogen electron microscopy. However, size limitations are preventing wider applications of the technique because small proteins have poor signal to noise ratios and are not possible to distinguish in single-particle images. The hypothesis of this project is that it is possible to image very small proteins, bypassing the conventional size limitations of single-particle cryo-EM, by utilizing a carrier protein-scaffold (Putrescine Aminotransferase; YgjG) connected through helical fusion to an affibody (Zwt) that can bind to a small protein of interest. The complex provides a sufficient size, symmetry, and rigidity for successful electron microscopy also of the non-covalently bound small protein of interest. To characterise the proposed scaffold, thermal stability through CD, binding of target protein in SPR, purity through SEC and experiments towards proof-of-concept in cryo-EM will be performed. The small protein of interest to be imaged in the proof-of-concept setup is another affibody, called Z963, that would be the smallest protein ever solved with cryo-EM. The results show that the investigated tetrameric protein scaffold is a highly stable protein (Tm~85oC) that can tolerate affibody fusion with retained binding function of multiple sites. The protein can be recombinantly expressed and purified in high yield and forms tetramers also when fused to affibody. The cryo-EM results are still pending, but promising grids have been created and in an initial particle selection clear 2-D classes that also reveal the small bound protein of interest have been generated. To conclude, biophysical characterization indicates that YgjG is a promising base structure for an imaging scaffold and preliminary single-particle cryo-EM analyses show that the proposed strategy to investigate structures of small proteins of interest is feasible.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-314597 |
| Date | January 2022 |
| Creators | Friberg, Oscar |
| Publisher | KTH, Proteinvetenskap |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2022:202 |
Page generated in 0.0037 seconds