Transgene Pflanzen nehmen einen wachsenden Stellenwert bei der Produktion therapeutischer Proteine, besonders von Impfstoffen, ein. Einige dieser Proteine benötigen für ihre Funktionalität verschiedenste post-translationale Modifikation und es ist nicht bekannt, ob Pflanzen zu diesen Stoffwechselleistungen befähigt sind. In der vorliegenden Arbeit sollte anhand eines bakteriellen Antigens geprüft werden, ob in Chloroplasten von Nicotiana tabacum an einem rekombinanten Protein eine besondere Form der post-translationalen Modifikation, die Lipidierung, durchgeführt wird und ob somit ein alternatives Produktionssystem für einen Lipoprotein-Impfstoff entwickelt werden kann. Basis für diese Untersuchungen war das bakterielle Lipoprotein OspA (outer surface protein A) aus Borrelia burgdorferi. Dieses Protein wird zur Prävention von Lyme-Borreliose eingesetzt und frühere Untersuchungen zeigten, dass OspA sowohl in B. burgdorferi als auch nach heterologer Expression in E. coli einer post-translationalen Lipidierung am N-Terminus unterliegt. Dabei wird das Protein unter Mitwirkung dreier Enzyme (Lgt, Lsp und Lnt) am N-Terminus mit einer Pam3Cys-Struktur versehen und die N-terminale Signalsequenz abgespalten. In dieser Arbeit konnten nach der Etablierung eines Expressionssystems mehrere unabhängige transplastome OspA-Tabakpflanzen generiert werden. Der Anteil an rekombinantem, plastidärem OspA (rpOspA) am löslichen Gesamtprotein wurde mit ca. 1% bestimmt. Dabei lag rpOspA sowohl in einer lipidierten, membrangebundenen als auch in einer nicht-modifizierten, löslichen Form vor. Strukturelle Untersuchungen an rpOspA ergaben, dass in Chloroplasten eine Bakterien-ähnliche Lipidierung an dem Protein durchgeführt wurde. Dabei wurde am N-Terminus ein Diacylglycerin über eine Thioetherbindung an das einzige in der Sequenz vorkommende Cystein gebunden. Anders als in Bakterien wurde die Signalsequenz in Chloroplasten jedoch nicht abgespalten und infolgedessen keine dritte Fettsäure an das Cystein gebunden. Die plastidäre Modifikation an rekombinantem OspA resultierte daher in einer Pam2Cys-Struktur mit Signalsequenz. Untersuchungen zur Immunogenität des rpOspA in Mäusen zeigten eindeutig, dass das rekombinante Protein aus Tabak die Bildung spezifischer Antikörper induziert und damit in seiner Wirkung vergleichbar dem bakteriellen Protein ist. Um die Lipidierungsrate des akkumulierten OspA in Chloroplasten zu erhöhen, wurden weitere transplastome Tabakpflanzen generiert. Diese wiesen neben dem ospA-Gen auch die Gene (lgt, lsp und lnt) der drei modifizierenden Enzyme aus E. coli auf. Durch die simultane Bildung von OspA und den drei modifizierenden Enzyme konnte eine quantitative Lipidierung von rpOspA mit einer Pam2Cys-Struktur erlangt werden. Als Grundlage für vergleichende Untersuchungen zwischen plastidärer und cytoplasmatischer Lipidmodifikation in Tabak wurden ebenfalls Transformationen des Zellkerns mit ospA durchgeführt, wobei jedoch keine heterologe ospA-Expression erreicht werden konnte. Erst durch die Anwendung eines transienten, viralen Expressionssystems war es möglich, ospA im Zellkern zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass in Chloroplasten Höherer Pflanzen eine Bakterien-ähnliche Modifikation an rekombinantem OspA durchgeführt wird und das resultierende Protein eine spezifische Immunantwort in Mäusen induzieren kann. Das Potential von transgenen Pflanzen als alternatives Produktionssystem für Lipoprotein-Impfstoffe wird diskutiert. / Transgenic plants play an increasing role in the production of therapeutical proteins, especially vaccines. Some of those proteins need a posttranslational modification for their activity of immunogenicity and it is still ambiguous if plants are capable of performing these modifications. In the present study it was investigated by the use of a bacterial antigen if a particular form of posttranslational modification, the lipidation of proteins, is performed in chloroplasts of Nicotiana tabacum and if the resulting plants could be further developed into an alternative production system for lipoprotein-vaccines. For this investigation, the bacterial lipoprotein OspA (outer surface protein A) of Borrelia burgdorferi was chosen, a protein used as a vaccine against Lyme disease. Previous studies have been shown that OspA is lipidated on its N-terminus both in B. burgdorferi and when expressed in Escherichia coli. This modification is performed by three different enzymes (Lgt, Lsp and Lnt) which build up a Pam3Cys-structure at the N-terminus of the protein while the N-terminal signal sequence is cleaved. In the present study several independent transgenic plant lines could be generated by the use of a suitable expression system. Analysis showed that the fraction of recombinant plastidal OspA (rpOspA) in transplastomic plants reached approx. 1% of the total soluble protein. Moreover, a lipid modification could be detected in a fraction of the rpOspA which resulted in the membrane association of a portion of the recombinant protein. The structural analysis of rpOspA revealed that in chloroplasts, rpOspA is lipidated in a bacteria-like manner, including the attachment of a diacylglycerol moiety to the sole cysteine via a thioether linkage. Other than in bacteria, the signal peptide is not cleaved in chloroplasts; thus, no additional fatty acid is attached to the cysteine. The plastidal modification on recombinant OspA therefore resulted in a Pam2Cys-structure including the signal sequence. Furthermore, the rpOspA from tobacco showed similar immunogenic properties as the recombinant protein from bacteria when tested in mice, showing the potential of plants as a production system for lipoprotein-vaccines. To further increase and modify the lipidation rate and pattern of tobacco-derived OspA, a new set of transplastomic tobacco plants were generated. These plants not only carried the ospA gene, but also the genes encoding for the three modifying enzymes (lgt, lsp and lnt). This simultaneous expression shifted the ratio between lipidated and non-lipidated rpOspA almost quantitatively to the lipidated form. For further comparisons of the OspA-lipidation either in plastids or in the cytosol transgenic tobacco plants were established. However, after stable integration of ospA into the nuclear genome, no detectable heterologeous expression could be achieved. Only by using a transient viral expression system the nuclear ospA expression was feasible. In this study it has been shown, that in chloroplasts of higher plants a bacteria-like modification on recombinant OspA was performed and that the resulting protein induced a specific immune response in mice. The potential of transgenetic plants as an alternative production system for lipoprotein-vaccines is discussed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:1353 |
| Date | January 2005 |
| Creators | Glenz, Karin |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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