This study set out to express, purify and characterize twelve ammonia lyase enzymes for potential application as a supplement to a treatment of an inborn error of metabolism disease. The DNA sequence for two wild-type ammonia lyases, three modified ammonia lyases and seven resurrected ancestral ammonia lyases had been synthesized and cloned in vectors. These were transformed into Escherichia coli, expressed, purified using immobilized metal affinity chromatography and size exclusion chromatography and characterized. Ten of the enzymes were successfully expressed and purified. All enzymes had a higher turnover number with substrate 1 than with substrate 2. The wild-types showed the highest catalytic turnover and one of them displayed substrate cooperativity. The modified enzymes were inactive. Some ancestral enzymes were active and had decreasing kcat with age. A promising ancestral enzymes was found that showed a kcat of 2,85 s-1 with substrate 1 and 1,82 s-1 with substrate 2. The ancestral enzymes had a lower Km with substrate 2 compared to substrate 1, while one of the wild-types had a higher Km with substrate 2 than with substrate 1, indicating that the substrate affinity has switched. The ancestral enzymes had increased thermostability compared to the wild-types which increased with age. Ranging from a +7C increase in melting temperature with the youngest ancestral enzyme to +10,7C with the oldest tested enzyme, comparing with one of the wild-types. The promising ancestral enzyme displayed a higher stability than the wild-types during long term incubation in 37_C and 25_C, since it did not become prone to aggregation,it did not show visible degradation on SDS-PAGE and it retained the highest activity following incubation. It was also demonstrated that neither wild-types nor the promising ancestral enzyme were stable in a simulated gut environment. The promising ancestral enzyme and one of the wild-types degraded substrate 1 and 2 in serum. Using the resurrection of ancestral sequences a promising enzyme has been produced and characterized, displaying properties that are desired in therapeutic enzymes. The enzyme did not aggregate or become prone to aggregation over time, it was thermostable, it was active in serum and had acceptable catalytic properties. For therapeutic application of the ancestral enzyme, immunogenicty should be analyzed in silico and in vitro followed by further investigation in vivo. / Målet med denna studie var att uttrycka, rena och karaktärisera tolv ammonia lyase enzymer, för potentiell användning som komplement till en behandling utav en sjukdom, som tillhör sjukdomsgruppen medfödda ämnesomsättningsrubbningar. DNA sekvensen för två vild-typammonia lyaser, tre modifierade ammonia lyaser och sju återuppväckta ammonia lyaser hade blivit syntetiserade och klonade i vektorer. E.coli celler blev transformerade med vektorerna, vilka uttryckte enzymerna, som renades med hjälp av immobilized metal affinity chromatography och gelfiltrering och karaktäriserades. Tio utav enzymerna kunde uttryckas och renas. Alla enzymer hade högre katalytisk omsättning av substrat 1 än substrat 2. Vildtyperna hade högst kcat med båda substrat och en utav dem uppvisade substratsammarbete. De modifierade enzymerna var inaktiva. Några av de återuppväckta ammonia lyaserna var aktiva och kcat minskade med ålder. Ett av de återuppväckta enzymerna var lovande och hade ett kcat värde av 2,85 s-1 med substrat 1 och 1,82 s-1 med substrat 2. De återuppväckta enzymerna hade ett lägre Km värde för substrat 2 än substrat 1, jämfört med en utav vildtyperna som hade ett högre Km värde för substrat 2 än substrat 1, vilket indikerar ett skifte i substrataffinitet. De återuppväckta enzymerna var mer termostabilia än vild-typerna och termostabiliteten ökar med ålder. Ökningen i smälttemperatur låg i spannet av +7C för de yngsta återuppväckta enzymerna till + 10,7C för det äldsta testade återuppväckta enzymet, vid jämförelse med en utav vild-typerna. Det lovande återuppväckta enzymet demonstrerade även en högre stabilitet än vild-typerna under långtidsinkubering, eftersom den inte blev benägen att aggregera, den uppvisade ingen nedbrytning på SDS-PAGE och den behöll högst aktivitet efter inkubering. Det bevisades även att varken vild-typerna eller det lovande återuppväckta enzymet var stabila i en simulerad magsäcksmiljö. Både det lovande återuppväckta enzymet och en av vild-typerna bröt ner substrat 1 och 2 i serum. Genom att återuppväcka sekvenser kunde ett lovande enzym produceras och karaktäriseras, vilket uppvisade egenskaper som är eftertraktade i terapeutiska enzymer. Enzymet aggregerade ej, det blev inte benäget att aggregera över tid, det var termostabilt, det var aktivt i serum och hade acceptabla katalytiska egenskaper. För terapeutisk applikation av det återuppväckta enzymet, borde analys av dess immunogenicitet utföras in silico och in vitro följt av vidare undersökning in vivo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-261355 |
| Date | January 2019 |
| Creators | Holmberg Larsson, Albin |
| Publisher | KTH, Skolan för kemi, bioteknologi och hälsa (CBH) |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2020:027 |
Page generated in 0.002 seconds