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Previous issue date: 2012 / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / O vírus Influenza é o responsável pela gripe, uma doença que ocasiona milhões de mortes e hospitalizações todos os anos. Nas infecções severas, especialmente em pessoas com risco para complicações, os antivirais tornam-se os principais meios para o manejo clínico, merecendo especial destaque os inibidores da neuraminidase (INAs). De fato, na pandemia de 2009 a Organização Mundial da Saúde (OMS) recomendou o uso do oseltamivir para o tratamento dos doentes. Porém, devido à evolução genética viral, surgiram cepas com mutações no gene codificador da neuraminidase (NA) responsáveis por substituições aminoacídicas que levam à resistência aos fármacos INAs. Assim, a OMS passou a recomendar a vigilância de resistência genotípica para os vírus Influenza. Este trabalho teve como objetivos verificar a ocorrência de mutações no gene codificador da NA dos vírus Influenza A (H1N1) pandêmico que possam estar relacionadas à resistência aos INAs em cepas circulantes na mesorregião metropolitana de Belém no período de maio de 2009 a maio de 2012 e analisar, através da modelagem de proteínas, as substituições aminoacídicas da NA que possam estar influenciando na conformação protéica. Durante o período de estudo, foram recebidas no Laboratório de Vírus Respiratórios 2619 amostras clínicas de pacientes que apresentavam sinais e sintomas de infecção respiratória aguda com até cinco dias de evolução. Para a detecção do genoma viral foi feita a extração do RNA viral, seguida de RT-PCR em tempo real utilizando marcadores específicos para Influenza A H1N1pdm, resultando em 744 (28,4%) positivas. Parte das amostras positivas foram então inoculadas em células MDCK. Para as amostras isoladas em cultura de células, foi feita uma nova extração do RNA viral seguida de uma RT-PCR e semi-nested (PCR) utilizando iniciadores específicos para o gene NA, e posterior análise em sequenciador automático ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems). A modelagem molecular da NA foi realizada através dos softwares SWISS-MODEL, MODELLER 9.10, PROCHECK, VERIFY3D e PYMOL. A análise parcial das sequências da neuraminidase nas amostras sequenciadas mostrou que não houve a circulação de cepas de vírus H1N1pdm com a mutação H275Y, a principal envolvida na resistência ao oseltamivir. Porém, em duas amostras foi identificada a substituição D199N que já foi relatada em vários estudos mostrando uma possível associação com o aumento da resistência ao oseltamivir. As amostras de 2012 apresentaram duas substituições (V241I e N369K) que estão relacionadas com um possível papel na compensação dos efeitos negativos causados pela mutação H275Y. A modelagem molecular mostrou que na mutação D199N houve uma alteração na estrutura da proteína NA próxima ao sítio de ligação ao antiviral. A análise filogenética revelou que as amostras de 2012 formaram um cluster isolado, demonstrando uma variação muito mais temporal do que geográfica. Este representa o primeiro estudo de resistência dos vírus Influenza H1N1pdm na mesorregião metropolitana de Belém, representando um importante instrumento para que os profissionais de saúde adotem estratégias mais eficazes no manejo da doença e no desenvolvimento de novos fármacos anti-influenza. / Influenza virus is responsible for the flu, a disease that causes millions of hospitalizations and deaths every year. In severe infections, especially in people at risk with comorbidities for complications, antiviral become the main means for clinical management, mainly the neuraminidase inhibitors (INAs). By fact, in the 2009 pandemic episode the World Health Organization (WHO) recommends the use of Oseltamivir for the treatment of patients. However, due to viral genetic evolution emerged strains with mutations in the gene coding for the neuraminidase (NA) responsible for amino acid substitutions that lead to drug resistance INAs. Thus, WHO began recommending surveillance genotypic resistance to influenza viruses. Our study aimed to verify the occurrence of mutations in the NA encoding gene of Influenza virus A (H1N1) pandemic strains that could be related to INAs resistance in the Belém mesoregion from May 2009 to May 2012 and analyze, through modeling of proteins, NA amino acid substitutions that may be altering the protein conformation. During the study period, were received 2619 clinical samples at the Virus Respiratory Lab in Evandro Chagas Institute in Belém – Brazil, from patients presenting signs and symptoms of acute respiratory infection with up to five days from the start of symptoms. For the detection of the viral genome viral RNA extraction was made followed by real time RT- PCR using specific markers for Influenza A H1N1pdm, resulting in 744 (28.4%) positive samples. A portion of the positive samples were then inoculated in MDCK cells and isolated samples were then submitted to a new viral RNA extraction followed by real time RT-PCR and semi-nested reaction (PCR) using primers specific for the NA gene. Subsequent analysis was done in 3130xl ABI Prism automatic sequencer (Applied Biosystems ). Molecular modeling was performed to the NA gene using SWISS-MODEL software, MODELLER 9.10, Procheck, VERIFY3D and PYMOL. The analysis of partial sequences of neuraminidase showed no circulation of the H1N1 pdm with H275Y mutation, the principal involved in resistance to oseltamivir. However in two samples were identified the D199N substitution that has been reported in several studies showing a possible association with increased resistance to oseltamivir. The samples of 2012 showed two substitutions (V241I and N369K) which are relate to a possible role in offsetting the negative effects caused by the H275Y mutation. Molecular modeling shows that the mutation D199N caused a change in protein structure near the NA-antiviral binding site. Phylogenetic analysis revealed that 2012 samples formed an isolated cluster, showing a much more temporal variation than geographic. This represents the first study of drug resistance of influenza virus in H1N1pdm metropolitan mesoregion of Belém - Brazil an important tool for health professionals to adopt more effective strategies for disease management and the development of new anti-influenza drugs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpa.br:2011/6783 |
| Date | 26 October 2012 |
| Creators | BARBAGELATA, Luana Soares |
| Contributors | SOUSA, Rita Catarina Medeiros |
| Publisher | Universidade Federal do Pará, Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais, UFPA, Brasil, Núcleo de Medicina Tropical |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPA, instname:Universidade Federal do Pará, instacron:UFPA |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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