Les ribozymes sont des ARN catalytiques fréquemment exploités pour le
développement d’outils biochimiques et d’agents thérapeutiques. Ils sont particulièrement
intéressants pour effectuer l’inactivation de gènes, en permettant la dégradation d’ARNm ou
d’ARN viraux associés à des maladies. Les ribozymes les plus utilisés en ce moment pour le
développement d’agents thérapeutiques sont les ribozymes hammerhead et hairpin, qui
permettent la reconnaissance spécifique d’ARN simple brin par la formation de structures
secondaires stables. In vivo, la majorité des ARN adoptent des structures secondaires et
tertiaires complexes et les régions simples brins sont parfois difficiles d’accès. Il serait
intéressant de pouvoir cibler des ARN repliés et un motif d’ARN intéressant à cibler est la
tige-boucle d’ARN qui peut être importante dans le repliement global des ARN et pour
accomplir des fonctions biologiques.
Le ribozyme VS de Neurospora fait la reconnaissance de son substrat replié en tigeboucle
de façon spécifique par une interaction kissing-loop, mais il n’a jamais été exploité
pour faire la reconnaissance d’un ARN cible très différent de son substrat naturel. Le but des
travaux présentés dans cette thèse est de déterminer si le ribozyme VS possède l’adaptabilité
nécessaire pour l’ingénierie de ribozymes qui clivent des ARN cibles différents du substrat
naturel. Dans le cadre de cette thèse, le ribozyme VS a été modifié pour l’adapter à différents
substrats et des études de cinétiques ont été réalisées pour évaluer l’impact de ces
modifications sur l’activité de clivage du ribozyme. Dans un premier temps, le ribozyme a été
modifié pour faire la reconnaissance et le clivage de substrats possédant différentes longueurs
de tiges Ib. Le ribozyme a été adapté avec succès à ces substrats de différentes longueurs de
tige Ib, avec une activité qui est similaire à celle du ribozyme avec un substrat sans
modification. Dans un deuxième temps, c’est l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme qui a
été substituée de façon rationnelle, dans le but de savoir si un ribozyme VS mutant peut
reconnaitre et cliver un substrat ayant une boucle différente de celle de son substrat naturel.
L’interaction kissing-loop I/V a été substituée pour les interactions kissing-loop TAR/TAR*
de l’ARN du VIH-1 et L22/L88 de l’ARN 23S de Deinococcus radiodurans. La réaction de
iii
clivage des ribozymes comportant ces nouvelles interactions kissing-loop est toujours
observée, mais avec une activité diminuée. Finalement, la sélection in vitro (SELEX) de
ribozymes a été effectuée pour permettre un clivage plus efficace d’un substrat mutant avec
une nouvelle boucle. Le SELEX a permis la sélection d’un ribozyme qui clive un substrat avec
une boucle terminale mutée pour celle de l’ARN TAR du VIH-1 et cela avec une activité de
clivage très efficace. L’ensemble de ces études démontre que le ribozyme VS peut être
modifié de diverses façons pour la reconnaissance spécifique de différents substrats, tout en
conservant une bonne activité de clivage. Ces résultats montrent le grand potentiel
d’ingénierie du ribozyme VS et sont prometteurs pour la poursuite d’études d’ingénierie du
ribozyme VS, en vue du clivage d’ARN cibles repliés en tige-boucle complètement différents
du substrat naturel du ribozyme VS. / Ribozymes are catalytic RNAs frequently exploited for the development of
biochemistry tools and therapeutic agents. They are particularly interesting in gene
inactivation strategies for the degradation of mRNA and viral RNA genome. Currently, the
most common ribozymes used in the development of therapeutic agents are the hammerhead
and hairpin ribozymes, which can specifically recognize and cleave target single-stranded
RNAs through the formation of stable secondary structures. In vivo, single-stranded RNAs
can be difficult to target because most RNA adopt complex secondary and tertiary structures.
It could be worthwhile to target folded RNA motifs, and an interesting target is the stem-loop
structure because stem-loops are important for the overall folding of RNA molecules and they
can perform important biological functions.
The Neurospora VS ribozyme recognizes its stem-loop folded substrate via a specific
kissing-loop interaction, but it has never been exploited for the recognition of target RNA very
different from its natural substrate. The goal of the work presented in this thesis is to
determine whether the VS ribozyme possesses the necessary adaptability for engineering
ribozymes that target RNAs different from its natural substrate. For this thesis, the VS
ribozyme was adapted for the recognition of different substrates and kinetic studies were
performed to evaluate the effect of these modifications on the cleavage activity. In a first
study, the VS ribozyme was modified to recognize and cleave substrates with different stem Ib
lengths. The VS ribozyme was successfully adapted to theses substrates of different lengths
with a cleavage activity similar to the unmodified ribozyme and substrate. In a second study,
the I/V kissing-loop interaction was substituted by rational design, in order to establish if the
VS ribozyme variants could recognize and cleave a substrate with a different loop than its
natural substrate. The I/V kissing-loop interaction was substituted for the HIV-1 TAR/TAR*
and the Deinococcus radiodurans RNA large rRNA subunit L22/L88 kissing-loop
interactions. The cleavage reaction was observed for the ribozymes with these new
interactions, but with reduced activity. Finally, in vitro selection (SELEX) was used to enable
more efficient cleavage of a mutant substrate with a new loop. SELEX experiments enabled
v
the selection of ribozyme variants that cleave a substrate with a terminal loop mutated to that
of the HIV-1 TAR RNA with a very efficient cleavage activity. All of the studies presented in
this thesis show that the VS ribozyme can be modified in various ways for the specific
recognition of different substrates, while maintaining efficient cleavage activity. These results
demonstrate the great potential of VS ribozyme engineering and are very promising for further
engineering studies of VS-derived ribozymes for the cleavage of stem-loop folded target RNA
completely different from its natural VS ribozyme substrate.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/15978 |
| Date | 31 December 2015 |
| Creators | Lacroix-Labonté, Julie |
| Contributors | Legault, Pascale |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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