O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma), o tipo mais prevalente de câncer do pâncreas, é uma neoplasia extremamente agressiva e com elevado índice de letalidade. Há uma necessidade premente de identificação de vulnerabilidades no PDAC que possam ser exploradas como alvos terapêuticos, e a utilização de modelos pré-clínicos que recapitulem a complexidade biológica e heterogeneidade clínica da doença é um aspecto central para a realização dessa tarefa. Os xenotransplantes de tecido tumoral derivado de pacientes (PDX, patient-derived tumor tissue xenografts), realizados em camundongos imunodeficientes, replicam com grande similaridade as principais características do tumor original e, assim, constituem uma ferramenta valiosa para o teste de drogas e estudos funcionais. Neste trabalho, 17 amostras cirúrgicas de PDAC humano foram implantadas subcutaneamente em camundongos nude atímicos. Sete tumores (41%) foram enxertados com sucesso e têm sido mantidos em sucessivas gerações de animais receptores. O exame histológico de seis desses xenoenxertos identificou características morfológicas compatíveis com os padrões reconhecidos no PDAC humano, assim como uma consistente similaridade de seu status de diferenciação histológica em relação aos perfis verificados nos tumoresoriginais. O cultivo in vitro de células derivadas de um dos xenotumores resultou em uma nova linhagem de câncer de pâncreas, com morfologia e cinética de crescimento comparáveis às de outras linhagens celulares de câncer pancreático. O potencial tumorigênico dessa nova linhagem foi validado in vivo, com uma consistente formação de tumores após inoculação em camundongos nude. A fim de aproveitar esse recurso para a investigação de potenciais alvos terapêuticos no PDAC, um rastreamento de vulnerabilidades moleculares foi realizado por meio de silenciamento gênico em larga-escala com RNA de interferência (RNAi). Uma biblioteca lentiviral de 4492 shRNAs (short hairpin RNAs), alvejando cerca de 350 genes envolvidos na regulação epigenética, foi empregada para a triagem de genes de suscetibilidade nas células derivadas de PDX, e em outras cinco linhagens tumorais pancreáticas (AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, MIA PaCa-2 e PANC-1). Inicialmente, foi realizada uma série de experimentos preliminares, visando à amplificação e controle de qualidade da biblioteca de silenciamento, à produção de vetores lentivirais e à padronização das condições experimentais para a transdução e seleção das células-alvo. Apenas três das linhagens avaliadas (AsPC-1, MIA PaCa-2 e PANC-1) mostraram-se permissíveis à transdução pelos vetores lentivirais, e foram assim utilizadas no screening de alvos epigenéticos. A análise dos dados obtidos nesse ensaio está em curso e os resultados serão utilizados para a definição de potenciais alvos candidatos. Em conclusão, recursos valiosos para apoiar a pesquisa sobre o câncer de pâncreas foram desenvolvidos. A coleção de PDXs estabelecida, bem como a linhagem celular recém-derivada, constituem uma fonte permanente e estável de células de PDAC para análises moleculares e estudos funcionais que busquem elucidar aspectos da doença ainda pouco compreendidos. Adicionalmente, os reagentes gerados e a expertise adquirida com os ensaiosrealizados com a biblioteca de shRNAs contra alvos epigenéticos serão de grande utilidade em futuras investigações para identificar genes com funções importantes na manutenção do fenótipo tumoral, e consequentemente com potencial para serem explorados terapeuticamente. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), the most prevalent type of pancreatic cancer, is a highly aggressive and lethal neoplasm. There is a pressing need to identify vulnerabilities in PDAC suited to be exploited as therapeutic targets, and the use of preclinical models recapitulating the biological complexity and clinical heterogeneity of the disease is central to this task. Patient-derived tumor tissue xenografts (PDX), established in immunodeficient mice, replicate with great similarity the main characteristics of the original tumor and thus constitute a valuable tool for drug testing and functional studies. In this work, 17 surgical samples of human PDAC were implanted subcutaneously in athymic nude mice. Seven tumors (41%) were successfully grafted and have been maintained through successive generations of recipient animals. Histological examination of six of these xenografts identified morphological characteristics compatible with the recognized patterns of human PDAC, as well as a consistent similarity of their histological differentiation status in relation to the profiles verified in the original tumors. In vitro culture of cells derived from one of these xenografts resulted in a new pancreatic cancer cell line, with morphology and growth kinetics comparable to those of other pancreatic tumor cells. The tumorigenic potential of this freshly derived cell line was validated in vivo, with a consistent tumor formation following inoculation into nude mice. To take advantage ofthis resource to investigate potential therapeutic targets in PDAC, a screening of molecular vulnerabilities was performed through large-scale gene silencing with RNA interference (RNAi). A lentiviral library containing 4492 short hairpin RNAs (shRNAs), targeting about 350 genes involved in epigenetic regulation, was employed for the search of susceptibility genes in the PDX-derived cells and in other five pancreatic tumor cell lines (AsPC-1, BxPC -3, Capan-1, MIA PaCa-2 and PANC-1). Initially, a series of preliminary experiments were carried out aiming at the amplification and quality control of the silencing library, production of lentiviral vectors and adjustment of the experimental conditions for transduction and selection of the target cells. Only three of the cell lines evaluated (AsPC-1, MIA PaCa-2 and PANC-1) were permissible for transduction by the lentiviral vectors, and were accordingly used in the screening of epigenetic targets. The analysis of data obtained in this trial is ongoing and the results will be used for definition of potential candidate targets. In conclusion, valuable resources to support research on pancreatic cancer have been developed. The established collection of PDXs as well as the newly derived cell line constitutes a permanent and stable source of PDAC cells for molecular analyzes and functional studies seeking to elucidate aspects of this disease that are still poorly understood. Additionally, both the reagents generated and the expertise gained from the RNAi assay against epigenetic targets will have inordinate usefulness in future investigations to identify genes with major functions in maintaining the malignant phenotype, and consequently with the potential to be exploited therapeutically.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-07052019-110949 |
| Date | 14 December 2018 |
| Creators | Moraes, Luís Bruno da Cruz e Alves de |
| Contributors | Reis, Eduardo Moraes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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