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Tiago Landim d'Avila Administração de plasmídeos....pdf: 1447180 bytes, checksum: b65ad3c9ece2b6f29cc032b2fa22c49a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-04T16:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Tiago Landim d'Avila Administração de plasmídeos....pdf: 1447180 bytes, checksum: b65ad3c9ece2b6f29cc032b2fa22c49a (MD5)
Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A interleucina-12 (IL-12) é uma glicoproteína heterodímerica, codificada por dois
genes distintos co-expressados na mesma célula. IL-12 precisa ser glicosilada para
exibir atividade funcional. Essa glicoproteína promove a diferenciação de células T e
é capaz de estimular a proliferação de células T ativadas e células NK. Além disso,
IL-12 promove a produção IFN-γ por células NK e o aumento da atividade lítica de
células NK e linfócitos T CD+ citotóxicos. Várias das atividades de IL-12 são
desempenhadas ou são amplificadas pela associação com IL-2. Em nosso
laboratório, foi gerada uma construção plasmideal capaz de expressar IL-12 canina,
na forma de proteína de fusão de cadeia única (pcDNA3.1-scca-IL-12), e outra
construção plasmideal capaz de expressar IL-2 canina (pcDNA3.1-ca-IL-2) em
células de mamífero. Experimentos preliminares, a combinação de IL-12 e IL-2
expressas em sobrenadantes de células COS-7 mostrou-se capaz de promover
produção de IFN-γ em células mononucleares de sangue periférico (CMNSP) de
cães sadios. Visando a avaliação do potencial do uso de IL-12 e/ou IL-2 para o
desenvolvimento de vacina ou método imunoterapico, no presente trabalho, grupos
de cães sadios foram injetados três vezes, com intervalo de 2 dias entre cada duas
doses consecutivas, com plasmídeo pcDNA3.1-scca-IL-12 e/ou pcDNA3.1-ca-IL-2
por via muscular por eletroporação. Em seguida, os cães foram submetidos à
avaliação clinica, clinico-laboratorial (hemograma, determinação da concentração de
transaminases, proteínas, ureia e creatinina no soro) e ensaios foram realizados
para a detecção da expressão das proteínas recombinantes (sensibilização de
CMNSP para produção de IFN-γ e determinação da concentração de IL-2 no soro).
Não foram observadas diferenças nos parâmetros avaliados entre os grupos de
animais. Visando a produção de IL-12, células BTI-Tn-5B1-4 foram infectadas com
baculovírus recombinante contendo cDNA scca-IL-12 e capazes de adicionar uma
cauda de 6 histidinas na extremidade carboxila. Para isso, duas construções
diferentes em baculovírus foram elaboradas nosso laboratório, sendo uma delas no
presente trabalho. Células BTI-Tn-5B1-4 infectadas com as construções em
baculovírus apresentaram a proteína recombinante: a) parcialmente degradada e em
grande quantidade no sedimento celular e b) integra e em baixa quantidade no
sobrenadante da cultura; de acordo com os resultados de obtidos por SDS-PAGE e
Western blot. / Interleukin-12 (IL-12) is a heterodimeric glycoprotein, encoded by two distinct genes
co-expressed in the same cell. IL-12 needs to be glycosylated to display functional
activity. This glycoprotein promotes differentiation of T cells and is capable of
stimulating proliferation of activated T cells and NK cells. In addition, IL-12 promotes
IFN-γ production by NK cells and increased lytic activity of NK cells and cytotoxic Tlymphocyte
CD +. Several of the activities of IL-12 are held or amplified by the
association with IL-2. In our laboratory, a plasmideal construction was generated to
express canine IL-12 like single-chain fusion protein (pcDNA3.1-scca-IL-12), and
other construction to express canine IL-2 (pcDNA3.1-CA-IL-2) in mammalian cells.
Preliminary experiments, the combination of IL-12 and IL-2 supernatants expressed
in COS-7 cells was able to promote IFN-γ in peripheral blood mononuclear cells
(PBMC) of healthy dogs. To assess the potential of using IL-12 and/or IL-2 for the
development of vaccine or immunotherapy method, in this study, groups of healthy
dogs were injected three times with an interval of 2 days between each two
consecutive doses with plasmid pcDNA3.1-scca-IL-12 and/or pcDNA3.1-ca-IL-2
intramuscularly by electroporation. Then the dogs were submitted to clinical
evaluation, clinical and laboratory (blood count, determination of the concentration of
transaminases, proteins, urea and serum creatinine) and tests were performed to
detect the expression of recombinant proteins (PBMC sensitization to produce IFN-γ
concentration and determination of serum IL-2). No differences were observed in all
evaluated parameters between the groups of animals. Aiming the production of IL-12
cells, BTI-Tn-5B1-4 were infected with recombinant baculovirus containing cDNA
scca-IL-12 and capable of adding a tail of 6 histidines at the carboxyl end. For this,
two different constructs were prepared in our laboratory baculovirus, one of them in
this work. Cells BTI-Tn-5B1-4 infected with the constructs presented in the
recombinant baculovirus: a) partially degraded in large quantities in the sediment cell
and b) incorporates and in low quantities in the culture supernatant, according to the
results obtained by SDS-PAGE and Western blo
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/4317 |
| Date | January 2011 |
| Creators | D'Avila, Tiago Landim |
| Contributors | Schriefer, Nicolaus Albert Borges, Soares, Milena Botelho Pereira, Oliveira, Geraldo Gileno de Sá |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Tiago Landim D'Avila, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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