Estudos recentes têm revelado que uma fração significativa do transcriptoma de eucariotos é composta por RNAs não codificadores longos (lncRNAs). Este trabalho investigou o padrão de expressão de um conjunto de lncRNAs originados a partir de regiões intrônicas de genes codificadores de proteínas em três linhagens celulares tumorais humanas utilizando microarranjos de DNA customizados. Realizamos uma série de análises in silico com a perspectiva de identificar propriedades globais desses transcritos, tais como a abundância relativa em diferentes tecidos, características evolutivas, estruturais e regulatórias, além de possíveis funções celulares. Avaliamos também a contribuição da metilação do DNA, um mecanismo de silenciamento epigenético da expressão de genes codificadores de proteínas, na regulação da expressão de lncRNAs intrônicos. Observamos que uma fração dos lncRNAs intrônicos detectados nas linhagens estudadas são conservados evolutivamente, tem padrão de expressão tecido específico, e está enriquecida em elementos regulatórios na sua extremidade 5\'. Foram identificados subconjuntos de lncRNAs intrônicos possivelmente atuando sobre genes associados a vias regulatórias importantes para o controle do desenvolvimento de organismos e ciclo celular. Comparativamente a mRNAs, uma menor proporção de lncRNAs intrônicos possui ilhas CpGs (CGIs) na vizinhança de seu início de transcrição. Apesar disso, observamos que um subconjunto desses transcritos teve sua expressão sensível ao tratamento com o agente desmetilante de DNA 5-AZA, demonstrando que lncRNAs intrônicos transcritos podem estar sujeitos a regulação transcricional mediada por metilação do DNA. Dentre os lncRNAs intrônicos regulados por metilação do DNA, destaca-se o lncRNA AS-APP, cuja expressão aumentou em 25 a 80 vezes nas linhagens celulares DU-145 e HEK293, respectivamente, após tratamento com 5-AZA. Este lncRNA possui uma CGI metilada e um promotor ativo a cerca de 4 kb de distância do seu início de transcrição conhecido. O aumento da transcrição do lncRNA AS-APP após desmetilação do DNA correlacionou-se a uma diminuição significativa dos níveis de expressão do mRNA do gene APP. Este resultado sugere uma possível ação regulatória em cis do lncRNA AS-APP no locus APP, um importante gene envolvido na doença de Alzheimer e com expressão associada ao prognóstico de alguns tipos de câncer. Os resultados obtidos neste trabalho reforçam a ideia de que lncRNAs intrônicos constituem unidades transcricionais independentes que se encontram sobre controle regulatório nos diferentes tipos celulares. Foi gerado também um catálogo de lncRNAs intrônicos regulados por metilação que permitirá a seleção de candidatos com maior potencial de relevância funcional para caracterização detalhada. / Recent studies have revealed that a significant fraction of the eukaryotic transcriptome is composed of long noncoding RNAs (lncRNAs). This work investigated the expression pattern in three human tumor cell lines of a set of lncRNAs originated from intronic regions of protein coding RNAs, using custom DNA oligoarrays. In silico analyses were performed to identify global properties of these transcripts such as relative abundance in different human tissues, regulatory, evolutionary and structural aspects, as well as their possible cellular functions. In addition, we evaluated the contribution of DNA methylation, an important epigenetic mechanism that control the expression of protein coding genes, in the regulation of intronic lncRNAs expression. We found that a fraction of the intronic lncRNAs detected in the cell lines are evolutionarily conserved, show a tissue specific expression pattern, and is enriched in regulatory elements at their 5\' end region. Subsets of intronic lncRNAs possibly acting on genes associated to important regulatory pathways controlling organism development and cell cycle were identified. A smaller proportion of intronic lncRNAs relative to mRNAs displayed CpG islands (CGI) in the vicinity of the transcription start site. Notwithstanding, we observed that a subset of these transcripts responded to treatment with the DNA demethylation agent 5-AZA, demonstrating that intronic lncRNAs may be under transcriptional regulation mediated by DNA methylation. Among intronic lncRNAs regulated by DNA demethylation, stands out AS-APP lncRNA, which was up regulated 25 to 80 times in DU-145 and HEK293 cell lines following 5-AZA treatment, respectively,. This lncRNAs has a methylated CGI and an active promoter at 4-kb upstream from its known transcription start site. Increased AS-APP lncRNA transcription following DNA demethylation correlated with a significant decrease of APP gene messenger RNA levels. This finding suggests a possible cis-regulatory action of the lncRNA AS-APP in the APP locus, an important gene involved in Alzheimer disease and whose expression is associated with prognosis of different cancer types. The results obtained in this study reinforce the idea that intronic lncRNAs constitute independent transcriptional units under regulatory control in the different cell types. It was generated a catalog of intronic lncRNAs regulated by DNA methylation that will allow the selection of candidates with higher potential of functional relevance for detailed characterization
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-10062013-104932 |
| Date | 27 September 2012 |
| Creators | Camargo, Lauren |
| Contributors | Reis, Eduardo Moraes Rego |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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