The nicotinic acetylcholine receptor of skeletal muscle is one of the best-investigated synaptic proteins and often serves as model for the entire family of pentameric ligand gated ion channels (pLGICs). Receptors of this superfamily share a common architecture. After binding the agonist the characteristic C-loop structure closes around the ligand-binding site and triggers a wave of conformational changes that spread through the protein and finally result in the opening of the channel gate. As shown before, high-resolution single channel data can hardly be described by simple kinetic mechanisms (Parzefall et al., 1998, Hallermann et al., 2005). Recent advances in the field of kinetic modelling on receptor currents demonstrate that the introduction of additional short lived shut states in kinetic schemes enhances the quality of estimates of reaction rates. The additional shut states that immediately follow ligand bound states in the mechanism are suggested to resemble the closing movement of the C-loop (Lape et al., 2008; Mukhtasimova et al., 2009). It has not been described yet whether and how the structural differences of the 2 binding sites of the receptor influence the opening behaviour. To address this question, high-resolution single channel recordings, in combination with agonists that are known to exhibit different binding site selectivity, were performed. Thereby, a detailed description of the binding site dependent generation of channel currents is possible. At the embryonic mouse-muscle receptor used in this study the ligand binding sites are located at the α-γ and α-δ subunit interfaces. By allocation of opening characteristics to the α-δ and α-γ sites it is possible to show the binding site dependent activation of distinct kinetic states. Furthermore, it will be shown that the recently introduced short-lived shut states are sufficient to describe high-resolution single channel data. Finally an enhanced kinetic mechanism based on the ‘primed states’ model, published in 2009 by Mukhtasimova et al., will be presented. In this model the structurally diverse α-δ and α-γ binding sites elicit different kinetic channel characteristics. Thus the complex high-resolution kinetic characteristics of the embryonic receptor can be described coherently. / Der nicotinische Acetylcholin-Rezeptorkanal des Skelettmuskels zählt zu den bestuntersuchten synaptischen Proteinen und gilt als Modell für die Familie der Liganden gesteuerten pentameren Ionenkanäle. Rezeptoren dieser Großfamilie besitzen als charakteristisches strukturelles Merkmal ein Cystein-Schleifen-Motiv (C-loop), welches sich nach Bindung eines Agonisten um die Bindungstasche herum schließt und eine Kette weiterer Konformationsänderungen nach sich zieht. Wie in früheren Publikationen festgestellt wurde, ist es nur schwer möglich hochaufgelöste Messdaten mit konservativen kinetischen Modellen ausreichend zu beschreiben (Parzefall et al., 1998; Hallermann et al., 2005). Aktuelle Fortschritte auf dem Gebiet der kinetischen Modellierung von mechanistischen Rezeptormodellen auf Rezeptorströme, zeigen, dass die Einführung zusätzlicher kurzlebiger Geschlossenzustände in den kinetischen Mechanismen die Qualität der Voraussagen der Modelle verbessert. Diese zusätzlichen Geschlossenzustände, welche Zuständen mit gebundenen Agonisten des Rezeptormodells folgen, spiegeln höchstwahrscheinlich die Schließung des Cystein-Schleifen-Motivs wider (Lape et al., 2008; Mukhtasimova et al., 2009). Trotz der jüngsten Fortschritte wurde bisher nicht beschrieben, wie und ob die strukturellen Unterschiede der 2 vorhandenen Bindungsstellen sich auf die Charakteristika des Öffnungsverhaltens auswirken. Die Bindungsstellen für Agonisten befinden sich am embryonalen nicotinischen Acetylcholinrezeptor des Muskels der Maus an den Schnittstellen der α-δ und der α-γ Untereinheiten. Um der Frage des Einflusses der Bindungsstellendiversität auf den Grund zu gehen, wurden hochaufgelöste Einzelkanalmessungen unter der Verwendung von unterschiedlichen Agonisten, für die bekannt ist, dass sie unterschiedliche Selektivitäten zu den Bindungsstellen besitzen, durchgeführt. Hierdurch ist es möglich ein detailliertes Bild der bindungsstellenbedingten Auslösung definierter Öffnungscharakteristika zu beschreiben. Durch die Zuweisung der Öffnungscharakteristika zu den α-δ und α-γ Bindungsstellen gelingt es die bindungsstellenabhängige Aktivierung von einzelnen kinetischen Zuständen zu zeigen. Darüber hinaus werden direkte Anhaltspunkte dafür gezeigt, dass es möglich ist mit den angeführten kurzlebigen Geschlossenzuständen hochaufgelöste Einzelkanaldaten kinetisch hinreichend zu beschreiben. Schließlich wird ein erweiterter kinetischer Mechanismus vorgestellt, welcher auf dem ‚primed-states’ Modell, das 2009 von Mukhtasimova veröffentlicht wurde, basiert. Zusätzlich ist dieser in der Lage die komplexen kinetischen Charakteristika des embryonalen nicotinischen Rezeptorkanals, unter hoher zeitlicher Auflösung der Messdaten, zu beschreiben.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:5976 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Stock, Patrick Maria |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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