O escorpião amarelo Tityus serrulatus (Ts) é considerado a espécie mais perigosa do Brasil, e muitas das toxinas de sua peçonha já foram isoladas e caracterizadas. No entanto, as frações XIIA e XIIB, obtidas da cromatografia de troca iônica da peçonha de Ts, possuem várias toxinas de baixa massa molecular ainda não caracterizadas. Através da combinação de técnicas de RP-FPLC em colunas C8 e C18, espectrometria de massas e/ou sequenciamento amino-terminal, foi possível isolar e identificar os componentes destas frações, bem como realizar as caracterizações estrutural, por RMN, e eletrofisiológica, por Two Microelectrode Voltage Clamp, de algumas neurotoxinas isoladas. Foram escolhidas três toxinas de interesse: Ts11, Ts9 e Ts1-G. Nossos resultados mostram que a Ts11 foi capaz de bloquear canais para potássio dependentes de voltagem (Kv): Kv1.2, Kv1.3, Kv4.2, Kv10.1, hERG, e Shaker IR, bloqueando em 25%, 27%, 25%, 15%, 12%, e 10% as correntes de potássio, respectivamente. A Ts11 possui uma estrutura única (estrutura obtida por RMN): ICK scaffold sem os elementos de estrutura secundária (alfa-hélice ou fita-beta). Esta estrutura diferenciada, somada à atividade biológica caracterizada neste estudo, evidencia uma nova subfamília de KTxs, a qual foi denominada como ?-KTx, sendo a Ts11 o primeiro membro desta subfamília: ?-KTx1.1. A caracterização funcional da Ts9 mostra que a mesma não apresenta atividade bloqueadora sobre os canais Kv testados (Kv1.1; Kv1.2; Kv1.3; Kv1.4; Kv1.5; Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv7.2; Kv10.1 hERG e Shaker IR), na concentração de 100 nM. Apesar da Ts9 não ter bloqueado os canais testados, ela apresenta estrutura e resíduoschave que sugerem sua ação em Kvs e estudo anteriormente publicado mostra que ela é um potente ligante de canais para potássio ativados por cálcio de baixa condutância (SK). Também foi conduzido um estudo comparativo entre a Ts1e sua isoforma precursora Ts1-G nos canais para sódio dependentes de voltagem Nav1.1 - 1.8 e DmNav1, a fim de analisar a importância da amidação C-terminal. A Ts1 madura possui região C-terminal amidada, enquanto que sua isoforma Ts1-G não é amidada, pois apresenta uma Gly na região Cterminal (última etapa de transformação pós-traducional, anterior a ação da enzima ?- amidante). A Ts1-G não apresentou ação nos canais (Nav) na concentração testada (100 nM), enquanto que a Ts1 (100 nM) age como ?- toxina, reduzindo o limiar de excitação dos canais Nav e/ou reduzindo as correntes de sódio, evidenciando que a amidação C-terminal é importante para a atividade biológica da toxina madura. Adicionalmente, nas análises por MALDI/TOF das frações XIIA e XIIB, foram encontrados 45 componentes cujas massas moleculares não correspondem a de toxinas já isoladas, abrindo perspectivas para a identificação de moléculas com potencial uso biotecnológico, visto que toxinas com ação em canais iônicos podem ser ferramentas valiosas para a elucidação das características farmacológicas, fisiológicas e estruturais dos seus alvos. / The yellow scorpion Tityus serrulatus (Ts) is considered the most dangerous species of Brazil, and several toxins present in its venom have been already isolated and characterized. However, fractions XIIA and XIIB obtained from ion exchange chromatography of Ts crude venom, presented many low molecular weight toxins which have not been characterized yet. Through a combination of RP-FPLC technique using C8 and C18 columns, mass spectrometry and / or amino terminal sequencing, it was possible to isolate and identify the components of these fractions, as well as perform structural characterization thru NMR and electrophysiological characterization using Two Microelectrode Voltage Clamp, of some of the neurotoxins isolated. It was choosen three toxins of interest: Ts11, Ts9 and Ts1-G. Our results show that Ts11 was able to block voltage gated potassium channels (Kv): Kv1.2, Kv1.3, Kv4.2, Kv10.1, hERG, and Shaker IR, blocking 25%, 27%, 25% 15%, 12% and 10% of the potassium currents, respectively. Ts11 has an unique structure (structure obtained thru NRM technique): ICK scaffold without the elements of secondary structure (alpha helix or beta-sheet). Additionaly, the differentiated structure and functional characterization, Ts11 shows us an evidence of a new subfamily of toxins, which was named as ?-KTX, and therefore, Ts11 is the first member of this subfamily: ?-KTx1.1. The functional characterization of Ts9 shows that it has no blocking activity on the tested Kv channels (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4, Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1, Kv3.1 , Kv4.2, Kv7.2, Kv10.1, hERG and Shaker IR) at a concentration of 100 nM. Despite the Ts9 have not blocked the tested channels, it presents structure and key-amino acid residues that suggest its action on Kvs and previously published study shows that it is a potent ligant for slow conductance calciumactivated potassium channels (SK). It was also conducted a comparative electrophysiological study between the Ts1and its precursor isoform Ts1-G on voltage gated sodium channels, in order to evaluate the importance of the C-terminal amidation. The mature Ts1 has amidated C-terminal region, whereas Ts1-G isoform is not amidated, and therefore has a Gly at the Cterminal region (last step of post-translational modification, before the action of the enzyme ?-amidante). The Ts1-G showed no action on Nav channels at the concentration tested (100 nM), whereas Ts1 (100 nM) acts as ?-toxin, lowering the excitation threshold of Nav channels and/or reducing sodium currents, evidencing that the C-terminal amidation is important for the biological activity of the mature toxin. Additionally, the analyses by MALDI/TOF of the fractions XIIA and XIIB showed several molecules whose molar masses do not match the toxins already identified, opening prospects for the identification of new molecules with potential biotechnological use, considering that toxins that act on ion channels can be valuable tools for the elucidation of pharmacological, physiological and structural characteristics of their targets.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29072015-113958 |
| Date | 22 May 2015 |
| Creators | Cremonez, Caroline Marroni |
| Contributors | Braga, Eliane Candiani Arantes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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