Das Lektin aus <i>Pisum sativum</i>, der Gartenerbse, ist Teil der Familie der Leguminosenlektine. Diese Proteine haben untereinander eine hohe Sequenzhomologie, und die Struktur ihrer Monomere, ein all-ß-Motiv, ist hoch konserviert. Dagegen gibt es innerhalb der Familie eine große Vielfalt an unterschiedlichen Quartärstrukturen, die Gegenstand kristallographischer und theoretischer Arbeiten waren. Das Erbsenlektin ist ein dimeres Leguminosenlektin mit einer Besonderheit in seiner Struktur: Nach der Faltung in der Zelle wird aus einem Loop eine kurze Aminosäuresequenz herausgeschnitten, so dass sich in jeder Untereinheit zwei unabhängige Polypeptidketten befinden. Beide Ketten sind aber stark miteinander verschränkt und bilden eine gemeinsame strukturelle Domäne. Wie alle Lektine bindet Erbsenlektin komplexe Oligosaccharide, doch sind seine physiologische Rolle und der natürliche Ligand unbekannt. In dieser Arbeit wurden Versuche zur Entwicklung eines Funktionstests für Erbsenlektin durchgeführt und seine Faltung, Stabilität und Monomer-Dimer-Gleichgewicht charakterisiert. Um die spezifische Rolle der Prozessierung für Stabilität und Faltung zu untersuchen, wurde ein unprozessiertes Konstrukt in <i>E. coli</i> exprimiert und mit der prozessierten Form verglichen. <br />
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Beide Proteine zeigen die gleiche kinetische Stabilität gegenüber chemischer Denaturierung. Sie denaturieren extrem langsam, weil nur die isolierten Untereinheiten entfalten können und das Monomer-Dimer-Gleichgewicht bei mittleren Konzentrationen an Denaturierungsmittel auf der Seite der Dimere liegt. Durch die extrem langsame Entfaltung zeigen beide Proteine eine apparente Hysterese im Gleichgewichtsübergang, und es ist nicht möglich, die thermodynamische Stabilität zu bestimmen. Die Stabilität und die Geschwindigkeit der Assoziation und Dissoziation in die prozessierten bzw. nichtprozessierten Untereinheiten sind für beide Proteine gleich. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch unter nicht-denaturierenden Bedingungen die Untereinheiten zwischen den Dimeren ausgetauscht werden.<br />
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Die Renaturierung der unprozessierten Variante ist unter stark nativen Bedingungen zu 100 % möglich. Das prozessierte Protein dagegen renaturiert nur zu etwa 50 %, und durch die Prozessierung ist die Faltung stark verlangsamt, der Faltungsprozess ist erst nach mehreren Tagen abgeschlossen. Im Laufe der Renaturierung wird ein Intermediat populiert, in dem die längere der beiden Polypeptidketten ein Homodimer mit nativähnlicher Untereinheitenkontaktfläche bildet. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Renaturierung ist die Assoziation der entfalteten kürzeren Kette mit diesem Dimer. / The lectin from <i>Pisum sativum</i> (garden pea) is a member of the family of legume lectins. These proteins share a high sequence homology, and the structure of their monomers, an all-ß-motif, is highly conserved. Their quaternary structures, however, show a great diversity which has been subject to cristallographic and theoretical studies. Pea lectin is a dimeric legume lectin with a special structural feature: After folding is completed in the cell, a short amino acid sequence is cut out of a loop, resulting in two independent polypeptide chains in each subunit. Both chains are closely intertwined and form one contiguous structural domain. Like all lectins, pea lectin binds to complex oligosaccharides, but its physiological role and its natural ligand are unknown. In this study, experiments to establish a functional assay for pea lectin have been conducted, and its folding, stability and monomer-dimer-equilibrium have been characterized. To investigate the specific role of the processing for stability and folding, an unprocessed construct was expressed in <i>E. coli</i> and compared to the processed form.<br />
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Both proteins have the same kinetic stability against chemical denaturant. They denature extremely slowly, because only the isolated subunits can unfold, and the monomer-dimer-equilibrium favors the dimer at moderate concentrations of denaturant. Due to the slow unfolding, both proteins exhibit an apparent hysteresis in the denaturation transition. Therefore it has not been possible to determine their thermodynamic stability. For both proteins, the stability and the rates of association and dissociation into processed or unprocessed subunits, respectively, are equal. Furthermore it could be shown that even under non-denaturing conditions the subunits are exchanged between dimers.<br />
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Renaturation of the unprocessed variants is possible under strongly native conditions with 100 % yield. The processed protein, however, can be renatured with yields of about 50 %, and its refolding is strongly decelerated. The folding process is finished only after several days. During renaturation, an intermediate is populated, in which the longer of the two polypeptide chains forms a homodimer with a native-like subunit interface. The rate limiting step of renaturation is the association of the unfolded short chain with this dimer.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:56 |
| Date | January 2002 |
| Creators | Küster, Frank |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Biochemie und Biologie |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://opus.kobv.de/ubp/doku/urheberrecht.php |
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