Les protéines membranaires (PMs) sont les composants fonctionnels principaux des membranes biologiques. Les processus cellulaires fondamentaux sont régulés à l’aide des PMs. Malgré leur importance et leur intérêt scientifique et pharmaceutique, les structures des PMs ne représentent qu’une partie mineure des structures 3D répertoriées. Les PMs humaines sont des cibles particulièrement intéressantes mais parmi plus de 7000 PMs humaines, seules 30 structures ont été élucidées.Les raisons principales qui rendent les PMs très difficiles à étudier sont leur faible abondance et leur nature hydrophobe. En effet, le niveau d’expression des PMs dans leur environnement naturel est habituellement faible et la surexpression hétérologue aboutit souvent à une protéine inactive.Les connexines font partie de la famille des PMs intégrales de vertébrés. Elles sont largement exprimées dans tout le corps et sont impliquées dans les processus essentiels à un fonctionnement physiologique normal. En s’oligomérisant elles établissent des canaux intercellulaires qui forment des jonctions lacunaires. La communication des jonctions lacunaires joue un rôle essentiel dans la fonction des tissus et le développement des organes. Ainsi, les mutations génétiques des connexines provoquent des désordres héréditaires. Les connaissances actuelles portent principalement sur la physiologie des connexines et la perméabilité des pores. Difficiles à produire pure, homogène et en quantité suffisante pour la cristallisation, l’unique structure de résolution atomique de jonction lacunaire est un polymère de la connexine 26. La connexine 43 (Cx43), protéine de jonction lacunaire la mieux étudiée, est exprimée dans tout le corps humain. Les études structurales de microscopie électronique ont montré que le domaine cytoplasmique C-terminal de Cx43 (Cx43CT) est flexible et diminue la qualité de diffraction des cristaux 2D. La troncation de la majorité de Cx43CT améliore la résolution des segments transmembranaires de Cx43. Tronqué au niveau du résidu 263, le mutant Cx43-263T est néanmoins capable de former des cristaux 2D et de s’assembler en jonctions lacunaires. L’œuvre présenté est consacré à l’étude de Cx43, Cx43-263T et Cx43CT.L’optimisation des codons du gène de la connexine et la minimisation de la stabilité de la structure secondaire d’ARNm ont considérablement augmenté l’expression de Cx43 et Cx43-263T. De nouvelles procédures de purification de Cx43-263T et Cx43 ont été élaborées. La protéine purifiée a été reconstituée en polymère amphiphile amphipol A8-35 et caractérisée par des approches de SEC, DLS et SAXS. Des techniques indépendantes ont montré l’auto-assemblage de Cx43-263T fonctionnelle en hexamères.Cx43 homogène a été surexprimée dans E. coli, purifiée et caractérisée par SEC, DLS, DSC et SAXS. L’oligomérisation a été mesurée en fonction de la concentration.Cx43-263T et Cx43 fusionnées à la protéine Mistic ont été surexprimées dans E. coli. La séparation de Mistic de la connexin a été testée avec différentes protéases, jonctions, conditions de clivage et soit in vivo soit in vitro. Toutes les constructions ainsi générées ont démontré une haute résistance aux protéolyses spécifiques. Mistic (membrane integrating sequence for translation of integral membrane protein constructs) est une séquence de protéine de B. subtilis, qui permet l'adressage des PMs intégrales dans la membrane. Mistic a été surexprimée chez E. coli et la protéine homogène a été purifiée avec divers détergents. Alors que la structure tertiaire de Mistic, solubilisée avec de l'oxyde de lauryldimethylamine, est déjà déterminée, la structure native de Mistic dans un milieu lipidique, qui permettrait de comprendre sa fonction, n’est pas encore disponible. Dans le travail présenté ici, Mistic a été reconstituée dans des lipides différents et utilisée pour des essais initiaux de cristallisation in meso. Mistic a de plus été utilisée pour la production d’anticorps anti-Mistic. / Membrane proteins (MPs) are major functional components of biological membranes. Keycellular processes are regulated with the help of MPs. Despite high importance and greatscientific and pharmaceutical interest, structures of MPs represent only a tiny fraction of all3D structures in Protein Data Bank. Human MPs are particularly challenging targets. Out ofmore than 7000 human MPs, structures of only about 30 were elucidated.The main reasons which make MPs so difficult to study are their low natural abundance andhydrophobic nature. Expression level of MPs in their natural sources is usually rather low.Heterologous overexpression often leads to inactive protein.Connexins comprise a family of vertebrate integral MPs that are widely expressed throughoutbody and involved in a wide variety of processes essential for normal physiological function.They are able to oligomerize and form intercellular channels which compose gap junctions.Gap junctional communication plays crucial role in normal tissue function and organdevelopment. Connexin gene mutations cause a number of inherited disorders.By now a wealth of knowledge is available about physiology of connexins and their channelpore permeability. However, atomic resolution structure of gap junction channel formed byonly one connexin family member (connexin 26) was determined. This is mostly explained bydifficulty to produce sufficient for crystallization amount of pure and homogenous protein.Connexin 43 (Cx43) is the best-studied gap junction protein, and it is widely expressedthroughout the human body. Initial structural studies by electron microscopy have shown thatflexible C-terminal cytoplasmic domain of Cx43 (Cx43CT) worsens diffraction quality of 2Dcrystals. Removal of most of the Cx43CT improved resolution of transmembrane segments ofCx43. Truncated at residue 263 mutant of Cx43 (Cx43-263T) still was able to form2D crystals and assembled into gap junctions. Thus, the present work is dedicated to the studyof three forms of Cx43, namely Cx43-263T, Cx43CT, and full-length Cx43.Performed in our work connexin gene optimization for E.coli codon bias and minimization ofstability of mRNA secondary structure significantly enhanced expression of Cx43 and Cx43-263T. Procedures for Cx43-263T and Cx43 purification were developed. The purified proteinwas reconstituted into amphipathic polymer amphipol A8-35 and characterized by SEC, DLS,and SAXS. Applied independent techniques showed self-assembling of purified Cx43-263Tinto hexamers demonstrating its functionality.Cx43CT was overexpressed in E.coli and purified to homogeneity. The protein wascharacterized by SEC, DLS, TSA, and SAXS. The concentration-dependent oligomerizationwas established.In the beginning of our project Cx43-263T and Cx43 were overexpressed in E. coli usingMistic fusion protein. A number of constructs providing various linkers and proteaserecognition sites were generated. To remove Mistic from the produced proteins in vivo and invitro cleavage were tested. All generated constructs demonstrated high resistance to specificproteolysis in wide range of conditions.Mistic (membrane integrating sequence for translation of integral membrane proteinconstructs) from B. subtilis was overexpressed in E.coli and purified to homogeneity usingdifferent detergents. While the tertiary structure of solubilized in lauryldimethylamine oxideMistic was determined earlier, the native structure of Mistic in lipid environment elucidatingits function is not available yet. In the present work Mistic was reconstituted into differentlipids and used for initial in meso crystallization trials. Additionally, Mistic was used forproduction of anti-Mistic antibodies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014GRENY005 |
| Date | 10 March 2014 |
| Creators | Silacheva, Maria |
| Contributors | Grenoble, Gordeliy, Valentin |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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