Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen dienten zur Identifizierung von Faktoren, die das Zusammenspiel zwischen dem photosynthetischen Elektronentransport und den Reaktionen im Stroma koordinieren. Hierzu erfolgten Manipulationen von Elektronen- und/oder Metabolitverfügbarkeit im Chloroplasten. Als Untersuchungsmaterial dienten zunächst isolierte Spinat-Chloroplasten unter sättigendem CO2 und Pi. Durch die Herstellung transgener Kartoffelpflanzen, welche die zentralen Elektronenverteiler Fd I und FTR über- bzw. unterexprimieren, wurde die Elektronenverfügbarkeit im Chloroplasten dann dauerhaft verändert.
Auswirkungen von zusätzlichen Elektronenakzeptoren auf den Chloroplastenmetabolismus
Die Zugabe von verschieden „starken“ Elektronenakzeptoren zu Chloroplasten während der „steady state“-Photosynthese bei ausreichendem Lichtangebot hatte zwei Effekte zur Folge. Ein moderater Elektronenentzug (0,2 und 2 mM OAA, 0,2 mM Nitrit) beeinträchtigte ausschließlich den Aktivierungszustand der NADP-MDH, während die Aktivierungszustände von NAD(P)-GAPDH, FBPase und PRK nahezu unverändert waren. Auch qN, der stromale Metabolitgehalt und die [14CO2]-Fixierung waren nur geringfügig beeinflußt. qP hingegen war stark erhöht. Im Gegensatz dazu inhibierten Nitrit bzw. Methylviologen in höheren Konzentrationen die [14CO2]-Fixierung. Das ATP/ADP-Verhältnis stieg an und das NADPH/NADP-Verhältnis war nahezu unverändert. Eine extreme Erhöhung war im DHAP/PGA-Verhältnis und der stromalen FBP-Menge meßbar. Die Aktivierungszustände von FBPase und NADP-MDH nahmen nach Zugabe stark ab, während die Aktivierungszustände von NAD(P)-GAPDH und PRK unbeeinflußt blieben.
Zusammenspiel von Elektronenangebot und Effektoren auf die Redoxmodulation von Chloroplastenenzymen
Eine Veränderung im Elektronenangebot durch variierende Lichtintensitäten verdeutlichte, daß bei höheren Lichtintensitäten ein Großteil der Elektronen nicht für die CO2-Fixierung genutzt werden kann. Parallel zur Sättigung der CO2-Fixierung stiegen FBPase- und NADP-MDH-Aktivierungszustände an, während PRK und NAD(P)-GAPDH schon bei Intensitäten von 50 µE den maximalen Aktivierungszustand erreichten. Die Zugabe von Intermediaten, die positiv bzw. negativ auf den Aktivierungszustand der einzelnen Enzyme wirken, hatten wieder bei NADP-MDH und FBPase die deutlichsten Auswirkungen. Sowohl NAD(P)-GAPDH- als auch PRK-Aktivierungszustände waren nur unter Bedingungen erniedrigt, unter denen der Elektronenfluß stark herabgesetzt ist und im Stroma wenig ATP, Triosephosphate und 3PGA vorhanden sind. Demgegenüber reagiert NADP-MDH sehr sensitiv auf Umlenkung oder Erhöhung des Elektronenflusses. Im Fall der FBPase bestehen lineare Zusammenhänge zwischen FBP-Gehalt oder aktuellem Elektronendruck und dem Aktivierungszustand des Enzyms.
Die an Chloroplasten erhaltenen Ergebnisse zeigen:
Die Redoxmodulation im Licht spielt weder bei PRK noch bei NAD(P)-GAPDH eine herausragende Rolle. Die Bedeutung dieses grundlegenden Regulationsmechanismus liegt für beide Enzyme im Licht/Dunkel- und Dunkel/Licht-Übergang. Durch die „feed back“-Regulation der NADP-MDH durch NADP erfolgt bei diesem Enzym immer eine direkte Rückkopplung auf die Elektronenverfügbarkeit im Stroma. Aufgrund der sensitiven Reaktion auf Änderungen im NADPH/NADP-Verhältnis stellt das Enzym einen sehr guten Marker für den im Stroma vorherrschenden Elektrondruck dar. Die sensitiven Schritte im Calvin-Zyklus stellen die FBPase und die sehr ähnlich regulierte SBPase dar. Der aktivierende Effekt von FBP auf die FBPase wird durch den Elektronendruck in der Weise beeinflußt, daß eine Erhöhung der Lichtintensität in höheren Enzymaktivitäten unter vergleichbaren FBP-Konzentrationen resultieren. Bei einer Limitierung im Elektronenangebot scheint die Aktivierung dann unabhängig vom FBP-Gehalt zu sein. Restriktionen im Calvin-Zyklus, die zu einer verminderten FBP-Bereitstellung bei hohem Elektronenangebot führen, reichen für eine Aktivierung ebenfalls nicht aus. Somit stellt der aktuelle Aktivierungszustand des Enzyms einen kombinierten Effekt aus Elektronenverfügbarkeit und FBP-Gehalt dar.
Manipulation der Elektronenflüsse in vivo durch Veränderugen im Fd-Gehalt
Die Transformation von Kartoffelpflanzen mit dem homologen fed 1-cDNA-Klon (diese Arbeit) in „antisense“-Orientierung bewirkte eine maximal 50%ige Reduktion im Fd I-Proteingehalt. Eine weitere Reduktion im Fd I-Gehalt scheint für die Pflanze letal zu sein. Sowohl moderat supprimierte (80-100% des Wildtyp-Gehaltes) als auch stärker supprimierte Linien (50-80%) wiesen verstärkten zyklischen Elektronentransport und eine verringerte CO2-Assimilationsrate auf, zeigten aber kein Anzeichen von O2-Reduktion. Als Schutz gegen oxidativen Stress war in den „antisense“-Linien ein verminderter Elektronenfluß nachweisbar, indem die Effizienz der Lichtnutzung von PSI und PSII vermindert war. Dabei wurden zwei Strategien deutlich, die aber beide zu weniger funktionellem PS II und verringerten Quantenausbeuten führten: In den moderaten Linien war ein extremer DpH für diesen Effekt verantwortlich, während die stärker supprimierten Linien Photoinhibition zeigten. Weiterhin trat in den „antisense“-Linien eine bis zu 25%ige Reduktion im Chlorophyllgehalt bei erhöhten Chlorophyll a/b-Verhältnissen auf. Eine solche Akklimatisierung tritt bei Pflanzen auf, die an schwache Lichtintensitäten adaptiert sind und Starklicht ausgesetzt werden. Eine Überexpression des heterologen fed 1-cDNA-Klon aus Spinat in Kartoffelpflanzen hatte gegenteilige Effekte zur Folge. Die Elektronentransportketten zwischen den Photosystemen waren weniger reduziert, die Transformanten wiesen in Kurzzeitversuchen eine bis zu 10% höhere CO2-Assimilation auf und auch die Effizienz der Lichtnutzung war erhöht. Die im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen stark erhöhten Chlorophyllfluoreszenz-Endsignale deuten darauf hin, daß ein größerer Anteil stromaler Akzeptoren reduziert vorliegt. Gleichzeitig war das Chlorophyll a/b-Verhältnis erniedrigt. In Abhängigkeit von der Fd I-Menge, und im Endeffekt vermutlich durch die im Stroma verfügbare Akzeptor-Menge bedingt, erfolgt eine Erhöhung bzw. Erniedrigung von qP. Der permanent erhöhte Redoxstatus zwischen den Photosystemen scheint in den Fd I-Transformanten eine Adaptation des Chlorophyll a/b-Verhältnisses in die Richtung zu bewirken, daß im Fall der Unterexprimierer eine Anpassung in Richtung Starklicht erfolgt, während die Überexprimierer eine Schwachlichtanpassung zeigen. Ein Hinweis in diese Richtung ist die gute Korrelation zwischen qP und dem Chlorophyll a/b-Verhältnis.
Isolierung von ftr a- und ftr b-cDNA-Klonen aus Kartoffel und Herstellung transgener Kartoffelpflanzen
Für eine Manipulation der Elektronenflüsse in Richtung Td erfolgte eine „antisense“-Transformation mit dem ftr b-cDNA-Klon aus Kartoffelblatt (diese Arbeit). Die primären Transformanten wiesen keinen Phänotyp auf. Eine Transformation im heterologen System mit dem „antisense“-ftr b-cDNA-Klon aus Spinat erwies sich als ineffektiv. Eine Überexpression des ftr b-cDNA-Klons aus Spinat in Kartoffel war erfolgreich; Pflanzen mit Cosuppression wurden nicht gefunden. Auch erfolgte in diesen Pflanzen keine Coregulation in der Expression der FTR A-Untereineinheit. Für eine Überexpression von funktioneller FTR könnte der ftr a-cDNA-Klon aus Kartoffelblatt (diese Arbeit) zusammen mit dem ftr b-cDNA-Klon transformiert werden.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-osnabrueck.de/oai:repositorium.ub.uni-osnabrueck.de:urn:nbn:de:gbv:700-2003061013 |
| Date | 10 June 2003 |
| Creators | Holtgrefe, Simone |
| Contributors | Prof. Dr. R. Scheibe, Prof. Dr. A. von Schaewen |
| Source Sets | Universität Osnabrück |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/msword, application/pdf |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/ |
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