Multizelluläre Gemeinschaften in Form bakterieller Biofilme stellen aus medizinischer Sicht ein großes klinisches Problem dar. Häufig lassen sich chronische oder rezidivierende Erkrankungen aber auch nosokomiale Infektionen auf die multizelluläre Lebensweise von humanpathogenen Erregern zurückführen. Sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Escherichia coli-Stämme besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, die die Biofilmbildung beeinflussen. Daran beteiligt sind unter anderem Flagellen, extrazelluläre polymere Substanzen, Adhäsine oder Oberflächen-assoziierte Proteine wie Autotransporter. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die funktionale Charakterisierung des Proteins Antigen 43 (Ag43). Aufgrund seiner Autoaggregation-vermittelnden Eigenschaft trägt Ag43 ebenfalls zur Mikrokoloniebildung und Biofilmreifung bei. Antigen 43 ist ein Autotransporterprotein, welches innerhalb der Bakterienspezies Escherichia coli weit verbreitet ist. Interessanterweise besitzen viele E. coli-Isolate gleich mehrere identische oder ähnliche Kopien von agn43, die in der Regel von variablen Genombereichen (genomische Inseln, Plasmide) kodiert werden. Am Beispiel der Antigen 43-Varianten des uropathogenen Escherichia coli (UPEC)-Stammes 536 (O6:K15:H31), des kommensalen E. coli Isolats Nissle 1917 (O6:K5:H1) sowie des E. coli K-12-Laborstammes MG1655 (OR:H48:K-) ist die Bedeutung des Autotransporterproteins im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht worden. Hierfür wurden die verschiedenen agn43-Allele in ein geeignetes Vektorsystem kloniert und im Adhäsin-freien Escherichia coli K-12-Stamm MG1655 ΔfimΔflu exprimiert. Da Antigen 43 in Wildtypstämmen posttranslational glykosyliert vorliegt, sind die Experimente zusätzlich unter Einfluß der heterologen, AIDA I-spezifischen Heptosyltransferase Aah (‘Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase’) durchgeführt worden. Anhand von Bindungsstudien (intermolekulare Autoaggregation, Zelladhäsionstests) wurde gezeigt, daß sich einzelne Ag43-Varianten teilweise in ihren Eigenschaften unterscheiden. Im direkten Vergleich mit AIDA-I (‘Adhesin Involved in Diffuse Adherence’) enteropathogener Escherichia coli (EPEC) konnte für Ag43 nur eine Funktion als schwaches Adhäsin nachgewiesen werden. Die heterologe O-Glykosylierung beeinflußte die Funktionalität des Antigen 43 in unterschiedlichem Ausmaß. Je nach Autotransporter-Variante führte die Heptosylierung entweder zu signifikant reduzierten Affinitäten, oder sie hatte keinen Effekt auf die Bindungskapazität des Ag43. Antigen 43 weist zudem strukturelle Homologien zu vergleichbaren Domänen anderer Autotransporter auf. Für viele dieser Proteine konnte bereits eine adhäsive oder invasive Funktion nachgewiesen werden. Eine mögliche Interaktion von Ag43 mit eukaryontischen Rezeptoren ist hingegen noch nicht bzw. nur unvollständig untersucht worden. In Overlay assays und ELISAs wurde für Antigen 43 hier erstmals die spezifische Bindung an die extrazellulären Matrixkomponenten Kollagen und Laminin gezeigt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß das Escherichia coli spezifische Autotransporterprotein Antigen 43 nicht nur an der bakteriellen Biofilmbildung, sondern auch an der Besiedlung epithelialer Gewebe beteiligt sein kann. Seine Expression verschafft Bakterien einen Kolonisationsvorteil, der mit erhöhter Fitneß einhergeht. Die Aah-vermittelte O-Glykosylierung scheint für die Funktionalität von Ag43 nicht zwingend erforderlich zu sein. Des weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Testsystem entwickelt worden, das auf der Basis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH) die Differenzierung von verschiedenen (uro-)pathogenen Mikroorganismen ermöglicht. Das etablierte Protokoll eignet sich nicht nur für die diagnostische Erregeridentifizierung, sondern auch in Abhängigkeit des Probenmaterials zur Untersuchung von (Multispezies-)Biofilmen. / Bacteria living in multicellular communities, i.e. biofilms, have evolved into a major health problem. Most chronic or recurrent diseases including nosocomial infections can be traced back to the multicellular lifestyle of pathogenic agents. Both facultative and obligate pathogenic strains of Escherichia coli express a multitude of diverse factors contributing to biofilm formation like flagella, extracellular polymeric substances, adhesins, or surface-exposed proteins, e.g. autotransporters. This work presents the functional characterization of the surface-associated protein antigen 43 (Ag43). Due to its autoaggregating phenotype, Ag43 is also involved in the formation of microcolonies and biofilms. Antigen 43 represents an autotransporter protein frequently expressed by all Escherichia coli pathotypes. Interestingly, many E. coli isolates encode multiple identical or orthologous copies of agn43 which are usually associated with mobile genetic elements (genomic islands, plasmids). Here, the antigen 43 variants of uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strain 536 (O6:K15:H31), commensal isolate E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1), and E. coli K-12 strain MG1655 (OR:H48:K-) have been analyzed. For this purpose, the different agn43-alleles were cloned into a capable vector system and subsequently expressed in Escherichia coli K-12 strain MG1655 ΔfimΔflu lacking the genes encoding type 1-fimbrial adhesins (fim) and antigen 43 (flu). Due to the occurrence of posttranslational glycosylation of Ag43 in wild type strains, experiments were additionally carried out upon co-expression of the heterologous AIDA-I-specific heptosyl transferase Aah (Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase). On the basis of binding studies (intermolecular autoaggregation, adhesion to eukaryotic cells) individual properties could be detected for each Ag43-variant. However, compared to AIDA-I (Adhesin Involved in Diffuse Adherence) of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains, antigen 43 was shown to act as a weak adhesin. Additionally, O-glycosylation partly influenced protein functions. Depending on the variant tested, posttranslational modification by Aah either resulted in significantly reduced affinities or had no effect on the binding capacity of Ag43. Furthermore, antigen 43 exhibits structural homologies compared to certain domains of related autotransporters. For many of these proteins, an adhesion- or invasion-mediating function could be demonstrated. To date, the interaction of Ag43 with a putative eukaryotic receptor has not been determined, yet. Here, it is shown for the first time that antigen 43 specifically binds to components of the extracellular matrix. Overlay assays and ELISAs identified collagen and laminin as epithelial receptors for Ag43. Taken together, the results obtained in this study confirm the functional role of antigen 43 in biofilm formation as well as its effect during bacterial colonization of epithelial tissues. Expression of the Escherichia coli-specific autotransporter protein is directly correlated to the improved fitness of bacteria infecting the human host. Aah-mediated O-glycosylation seems not to be strictly required for the function of Ag43. The second aim of this work was the design and development of a test system which can be used for the differentiation of (uro-)pathogenic microorganisms in biofilms. For this purpose, the FISH (Fluorescence-in-situ-Hybridization)-technique has been optimized for diagnostic applications. Depending on the specimen, the protocol can also be adapted to the analysis of (multispecies) biofilms.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:2910 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Reidl, Sebastian |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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