The predominant tool for adaptation in Gram-negative bacteria is a genetic system called integron. It rearranges gene cassettes, promoting multiple antibiotic resistances, a recognized major global health threat. It is based on a unique recombination process involving a Tyrosine recombinase – called integrase IntI – and folded single-stranded DNA hairpins – called attC sites. Four recombinases and two attC sites form a macromolecular synaptic complex, which is key to the entire recombination process and the focus of our study. The bottom strand of all attC sites shows highest recombination in vivo, however, it still varies greatly and the underlying reason is unknown. We hypothesize that the difference in recombination efficiency arises from the variable mechanical stability of the synaptic complex, which in turn is affected by the attC site. Here, we established an optical tweezers force-spectroscopy assay that allows us to probe the synaptic complex stability for different DNA substrates and protein variants. We discovered a strong correlation between recombination efficiency and the mechanical stability of the synapse, indicating a regulatory mechanism from the DNA sequence to the quaternary complex structure stability. We have discovered protein residues interacting with the DNA in trans, within the synaptic complex, which reduces its stability. Furthermore, we discovered that the C-terminal helix, a conserved structural feature of tyrosine recombinases plays a key role in the stabilization of the tetramer assembly on the DNA, which upon mutation significantly destabilized the synaptic complex. Expanding upon this new understanding of synapse stability regulation we developed a novel approach for destabilizing the synaptic complex, potentially reducing the recombination efficiency. We designed α-helix mimicking peptides that would compete with the C-terminal tail of the integrase, block the interlocking interaction, and lead to synaptic complex destabilization. We have observed a prominent destabilizing effect on the synaptic complex already at 10 µM peptide concentration. Overall, our findings reveal new regulatory mechanisms in the recombination efficiency of the bacterial integron and provide first data for the active synapse destabilization mechanism. This novel understanding of the regulatory role the synaptic complex plays in the recombination efficiency of the integron system introduces a new approach to reduce the spread of antibiotic resistance among bacteria. / Das vorherrschende Anpassungsmittel bei gramnegativen Bakterien ist ein genetisches System, das Integron genannt wird. Es ordnet Genkassetten neu an und fördert so multiple Antibiotikaresistenzen, die eine globale Gesundheitsbedrohung darstellen. Es basiert auf einem einzigartigen Rekombinationsprozess, an dem eine Tyrosin-Rekombinase - Integrase IntI genannt - und gefaltete einzelsträngige DNA-Hairpins - attC-Stellen genannt - beteiligt sind. Vier Rekombinasen und zwei attC-Stellen bilden einen makromolekularen synaptischen Komplex, der für den gesamten Rekombinationsprozess entscheidend ist und im Mittelpunkt unserer Forschung steht. Der untere Strang aller attC-Stellen weist in vivo die höchste Rekombinationsrate auf, die jedoch aus unbekannten Grund stark variier. Wir vermuten, dass der Unterschied in der Rekombinationsrate auf die unterschiedliche mechanische Stabilität des synaptischen Komplexes zurückzuführen ist, die wiederum von der attC-Stelle beeinflusst wird. Hier haben wir einen Test mittels Kraft-spektroskopie mit einer optischen Pinzette entwickelt, mit dem wir die Stabilität des synaptischen Komplexes für verschiedene DNA-Substrate und Proteinvarianten untersuchen können. Wir stellten eine starke Korrelation zwischen der Rekombinationsrate und der mechanischen Stabilität der Synapse fest, was auf einen Regulationsmechanismus zwischen der DNA-Sequenz und der Stabilität der quaternären Komplexstruktur hinweist. Wir haben Proteinreste entdeckt, die innerhalb des synaptischen Komplexes mit der DNA in trans interagieren, was zu einer Verringerung dessen Stabilität führt. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die C-terminale Helix, ein konserviertes Strukturmerkmal von Tyrosin-Rekombinasen, eine Schlüsselrolle bei der Stabilisierung des Tetramer-Aufbaus an der DNA spielt, die bei Mutation den synaptischen Komplex erheblich destabilisiert. Auf der Grundlage dieses neuen Verständnisses der Regulierung der Synapsenstabilität haben wir einen neuen Ansatz zur Destabilisierung des synaptischen Komplexes entwickelt, der die Effizienz der Rekombination verringern könnte. Wir entwarfen α-Helix-nachahmende Peptide, die mit dem C-terminalen Ende der Integrase konkurrieren, die Interlocking-Interaktion blockieren und zur Destabilisierung des synaptischen Komplexes führen. Wir haben eine deutliche destabilisierende Wirkung auf den synaptischen Komplex bereits bei einer Peptidkonzentration von 10 µM beobachtet. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse neue Regulationsmechanismen für die Rekombinationsleistung des bakteriellen Integrons auf und liefern erste Daten für den Mechanismus der aktiven Destabilisierung der Synapse. Dieses neue Verständnis der regulatorischen Rolle, die der synaptische Komplex bei der Rekombinationseffizienz des Integronsystems spielt, eröffnet einen neuen Ansatz zur Verringerung der Verbreitung von Antibiotikaresistenzen unter Bakterien.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:91109 |
| Date | 03 May 2024 |
| Creators | Vorobevskaia, Ekaterina |
| Contributors | Schlierf, Michael, Mazel, Didier, Spies, Maria, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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