Les Métalloprotéases matricielles (MMPs) constituent une famille des métalloprotéases à zinc capables conjointement de dégrader l'ensemble des protéines de la matrice extracellulaire. Aujourd'hui, vingt-trois MMPs humaines ont été identifiées et sont caractérisées par leur séquence en aminoacides et leur structure 3D fortement conservées. Ces enzymes sont exprimées de manière constitutive au cours des processus de remodelage tissulaire. Leur surexpression dans un certain nombre de pathologies étroitement liée au phénomène d'inflammation (arthrite, emphysème, cancer) fait des MMPs des cibles thérapeutiques de choix. Cependant, le remodelage entraînant des modifications des contacts cellulaires, les MMPs apparaissent aujourd'hui comme des protéines des voies de signalisation à part entière. Les récentes découvertes de substrats des MMPs ne faisant pas partie des constituants de la matrice extracellulaire renforcent cette vision. Dans le but d'identifier le rôle particulier et le taux d'expression protéique des MMPs dans un contexte pathologique, nous avons développé une technique de protéomique fonctionnelle dédiée à la détection des formes actives des MMPs dans des échantillons tumoraux. Cette technique repose sur le développement d'une nouvelle sonde de photoaffinité, basée sur la structure d'un puissant inhibiteur des MMPs de type phosphinique, permettant de cibler les MMPs sous forme active et de les isoler par marquage par photoaffinité. Le marquage par photoaffinité nous permet ainsi grâce à un élément radioactif incorporé à la sonde de radiomarquer les protéines ciblées. Cette sonde a montré in vitro sa capacité remarquable à modifier de manière covalente la hMMP-12 avec un rendement de 42 %, affichant une sensibilité extrême de détection (2.5 fmoles de hMMP-12). En présence de protéome complexe, la sensibilité de détection de la sonde pour la hMMP-12 est tout à fait comparable (5 fmoles) ; la hMMP-12 représente une fraction de 0.001 % de la quantité totale des protéines. Cette méthode nous a permis également d'identifier de manière indirecte les formes actives des gélatinases en comparant les extraits tumoraux traités par la sonde et les extraits tumoraux analysés en zymographie. Ces études indiquent que les niveaux d'expression des formes actives de MMPs sont très faibles (fmoles) ne permettant pas une caractérisation de celles-ci par spectrométrie de masse, ce qui constitue un véritable défi pouvant être abordé avec de nouvelles sondes incorporant une biotine. Cet exemple de protéines exprimées sous forme active en très faible abondance, implique une orientation des efforts à consentir vers le développement de nouvelles stratégies de capture.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00555061 |
| Date | 03 July 2007 |
| Creators | David, Arnaud |
| Publisher | Museum national d'histoire naturelle - MNHN PARIS |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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