La spectrométrie de masse est un outil performant pour identifier des biomarqueurs protéines dans des fluides biologiques. Plusieurs modes sont accessibles dont le mode « Data Independent Acquisition » (DIA), qui permet une sélection et une fragmentation exhaustive de tous les peptides détectables par l'appareillage. Cependant, ce mode génère des spectres de (co)-fragmentation très complexes rendant l'étape d'identification délicate. Pour surmonter cette limitation, nous nous sommes tournés vers une méthode d'activation des ions spécifique. La photodissociation laser (LID) à 473 nm, longueur d'onde à laquelle les peptides n'absorbent pas naturellement, a été implémentée dans un appareil Qexactive. La spécificité de fragmentation est induite après dérivation spécifique des peptides à cystéine (acide aminé rare présent globalement à 2 % mais présent dans 89 % des protéines) à l'aide d'un chromophore absorbant à 473 nm. Dans un premier temps, une bibliothèque de 354 spectres LID de peptides à cystéine dérivés a été créée pour le développement de la méthode DIA-LID. Cette méthodologie DIA-LID a ensuite été utilisée pour identifier et quantifier des biomarqueurs protéines kinases humaines putatifs endogènes au sein d'un extrait cellulaire mammaire cancéreux humain. Les comportements de fragmentation de 401 peptides à cystéine dérivés en LID à 473 nm ont également été étudiés permettant l'optimisation des méthodes d'identification et de quantification. Pour finir, une nouvelle méthodologie, intitulée C-trap-LID, a été appliquée pour repérer et extraire rapidement tous les m/z des ions précurseurs détectables par l'appareillage ayant photo-fragmentés dans une matrice complexe / Mass spectrometry is a powerful tool to detect putative proteins biomarkers in biological samples. Several methods are accessible, including Data Independent Acquisition (DIA) which allows the fragmentation of all detectable peptides in high resolution mass spectrometer. However, DIA methods are not able to exhaustively identify compounds due to the excessive complexity of fragmentation spectra of multiple precursor ions. Thus, we developed an alternative technique that adds specificity during fragmentation step to detect only a subset of peptides. We replaced the classical gas-collision fragmentation by a highly specific laser-induced photodissociation (LID) at 473 nm, for which peptides do not naturally absorb, in a Q-exactive. The specific absorption and photofragmentation is induced by grafting an adequate quenching chromophore to the thiol group of cysteine-containing peptides (a rare amino acid with a frequency of 2 % but present in 89 % of all human proteins) through a chemically controlled route. First, to develop the DIA-LID method, a spectral library including LID spectra of 354 cysteine-containing peptides was built. Then, this methodology was used to identify and quantify putative human protein kinases biomarkers in human cancerous mammalian cells. Simultaneously the fragmentation behavior of 401 derivatized cysteine-containing peptides was studied to rationalize the choice of peptides to provide the maximum of information to identify them in LID for discovery approaches. In closing, a new methodology named C-trap-LID, was introduced and applied to spot and extract quickly m/z related to all detectable derivatized cysteine-containing compounds in complex medium
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017LYSE1287 |
| Date | 29 November 2017 |
| Creators | Garcia, Leny |
| Contributors | Lyon, Lemoine, Jérôme, Girod, Marion |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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